MMP-2、MMP-9在老年结直肠癌中的表达及与其临床病理特征的关系

陈 翔 吴曙辉 陆宝华 袁 杰 耿春华 曾小兵

结直肠癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，近几年来，发病率明显上升，临床上判断预后多通过分析肿瘤大小、淋巴结转移情况、分期、组织分级等。基质金属蛋白酶中的基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)主要降解VI型胶原，参与肿瘤血管形成、肿瘤细胞的侵袭和转移［1］。本文通过免疫组织化学法检测老年结直肠癌患者中MMP-2、MMP-9的表达，探讨两者与结直肠癌患者临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取于2012年3月至2014年9月在我院普外科住院行结直肠癌根治术患者86例作为实验组，均经过病理组织学切片检查明确诊断，其中男性49例，女性37例，年龄63～84岁，平均年龄(65.2±5.3)岁。组织学类型:腺癌63例，其他类型23例。病理学分级:高分化32例，中分化33例，低分化21例。肿瘤直径＜5 cm者37例，5～10 cm者34例，＞10 cm者15例;局部有淋巴结转移者49例，无转移者37例;TNM分期:Ⅰ期23例，Ⅱ期31例，Ⅲ期26例，Ⅳ期6例。取该组病例距肿瘤边缘5 cm以上相应癌旁正常组织作为对照组。所有患者术前均未接受放疗、化疗或生物治疗。

1.2 试剂及仪器

兔抗人MMP2、MMP-9多克隆抗体、SP通用型试剂盒、DAB试剂盒、多聚赖氨酸、柠檬酸抗原修复液、PBS、过氧化氢、二甲苯，无水乙醇，石蜡，苏木精，中性树胶(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

超净工作台(Formal205型，美国);倒置显微镜(Olympus，日本);水浴箱(江苏金坑市医疗仪器厂);组织包埋机(SAKURA，日本);脱水机(TIYODA，日本);超薄切片机(Leica，德国);台式恒温振荡器(中国上海精宏实验设备有限公司);高压锅(美的，中国);电热风干燥箱(中国上海圣欣科学仪器有限公司);耐高温塑料染色架(中国福州迈新生物科技有限公司);计算机图像分析系统(惠普，美国)。

1.3 实验方法

福尔马林液固定;脱水、透明;浸蜡、包埋;切片、贴片、烤片;脱蜡、脱水;高压热修复;阻断:3%过氧化氢孵育10 min;封闭:山羊血清封闭液室温孵育10 min;加一抗50 μl室温静置1 h;加辣根过氧化物酶标记的二抗50 μl静置10 min;加链霉亲和素-过氧化物酶50 μl静置10 min;显色;终止;苏木精复染，盐酸酒精分化;常规脱水、透明;封片;显微镜下观察。

1.4 判断标准

以已知的该指标的免疫组化染色阳性片作为阳性对照，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，HE切片作为对照观察。

MMP-2、MMP-9阳性结果判定以细胞核不染色，细胞膜或胞质内出现棕色或棕黄色颗粒为阳性染色，阴性(-):染色细胞数≤10%;弱阳性(+):染色细胞数11% ～25%;阳性(++):染色细胞数26% ～50%;强阳性(+++):染色细胞数＞50%。以上均以(-)为阴性;(+)～(+++)为阳性。图像分析:计算机图像系统拍照，每张切片随机选取5个视野，并记录。

2 结果

2.1 MMP-2、MMP-9在两组中的表达情况

对两组组织进行免疫组化SP法检测，结果发现，实验组 MMP-2强阳性(+++)28例，阳性率73.26%，MMP-9强阳性(+++)表达32例，阳性率69.77%;对照组 MMP-2、MMP-9 均无强阳性表达，阳性率分别为11.63%、9.30%，两组比较差异均有统计学意义(MMP-2 χ2=66.853，MMP-9 χ2=65.765，P 均＜0.01)，见表1。

表1 MMP-2、MMP-9在两组中的表达情况

2.2 MMP-2、MMP-9表达与结直肠癌临床病理特征的关系

MMP-2和MMP-9的表达水平均与患者性别、肿瘤部位、肿瘤大小和病理学类型、组织学类型无关，而与肿瘤浸润深度、有无淋巴结转移及TNM分期有关(P ＜0.05)，见表 2。

3 讨论

结直肠癌作为常见的恶性肿瘤，老年人的发病率逐年升高，是由多因素、多基因、多阶段参与的，其恶性程度主要由浸润和转移特性决定，而这种特性又是由恶性肿瘤细胞的增殖、细胞外基质的降解及大量血管生成决定的［2］。

基质金属蛋白酶家族(MMPs)是蛋白水解酶家族，主要依赖锌离子，能够降解基底膜和细胞外基质，参与肿瘤的侵袭、转移［3］。MMP-2是非糖化明胶酶，研究表明MMP-2能够导致肿瘤细胞介导的细胞外基质降解，参与肿瘤新生血管形成、肿瘤细胞的浸润和转移［4］。除此之外，MMP-2还能调节细胞粘附，降低细胞间粘附力，肿瘤细胞易于脱落形成远处转移［5］。

MMP-9是明胶酶B，能够降解明胶、弹性纤维、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ和X型胶原，在多种恶性肿瘤中高表达，研究发现结直肠癌基底膜Ⅳ型胶原蛋白的缺失与组织MMP-9表达增强有关［6］。有报道称MMP-9拮抗剂抑制结直肠癌细胞黏附，表明MMP-9促进结直肠癌细胞的侵袭和转移［7］。

表2 MMP-2、MMP-9表达与结直肠癌临床病理特征的关系(例，%)

在本实验中，选取经病理证实为结直肠癌的组织作为实验组，癌旁正常组织作为对照组，采用免疫组织化学法检测两组组织内MMP-2、MMP-9的表达，结果发现实验组 MMP-2强阳性28例，阳性率73.26%，MMP-9强阳性表达32例，阳性率69.77%;对照组MMP-2、MMP-9均无强阳性表达，阳性率分别为11.63%、9.30%，两组比较差异有统计学意义。对两组组织中MMP-2、MMP-9的表达与性别、肿瘤部位、病灶大小、TNM分期、组织学类型、病理学类型、浸润深度、淋巴结转移等方面的关系进行分析，结果发现MMP2和MMP-9的表达水平均与患者性别、肿瘤部位、肿瘤大小和病理学分型、组织学类型无关，与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关，统计学显示有差异。这提示，MMP-2、MMP-9在结直肠癌组织中表达升高，并且随着肿瘤浸润深度深、有淋巴结转移、TNM分期越晚，结直肠癌组织中MMP2和MMP-9表达越高。既往研究表明，在人体多种恶性肿瘤中，MMP-2高表达导致细胞外基质降解，肿瘤新生血管生成，肿瘤发生浸润转移［8］。MMP-9在结直肠癌组织中高表达，在非癌组织中也有少量的表达，能够起到肿瘤抑制因子的作用［9］。截止目前，绝大部分研究均发现MMP-9能够加速肿瘤细胞增殖，促进结直肠癌的发生发展［10］。这均与本实验结果相一致。

综上所述，本研究发现MMP-2、MMP-9在结直肠癌组织中高表达，两者的表达与结直肠癌浸润深度、有无淋巴结转移及TNM分期有关，可能在肿瘤的发生、发展、浸润、转移过程中发挥重要作用。MMP-2和MMP-9与结直肠癌发生发展的具体机制仍需进一步实验研究，为临床上寻找结直肠癌新的治疗方式提供理论依据。

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