葛根素对极低频电磁辐射下RPE细胞增殖活性及转化生长因子β2的影响

田 甜 朱 煌

·论著：实验研究·

葛根素对极低频电磁辐射下RPE细胞增殖活性及转化生长因子β2的影响

田 甜 朱 煌

目的研究葛根素对极低频电磁场（ELF-EMF）作用下人视网膜色素上皮（RPE）细胞病理改变的影响，探讨其在近视防治中的可能作用。方法实验细胞分为对照组、辐射组、葛根素组（终浓度100μmol/L）。CCK8检测RPE细胞的增殖活性，Real-time PCR法检测RPE细胞中转化生长因子-β2（TGF-β2）mRNA的表达情况。ELISA检测RPE细胞培养上清中TGF-β2的蛋白含量。结果与对照组相比，辐射组RPE细胞增殖活性降低；TGF-β2 mRNA表达增高，RPE细胞上清中TGF-β2含量上调。与辐射组相比，葛根素组RPE细胞增殖活性增高，TGF-β2 mRNA表达降低，RPE细胞上清中TGF-β2含量下调，差异有统计学意义。结论ELF-EMF在一定范围内影响体外培养的RPE细胞的增殖活性及TGF-β2的表达与分泌，葛根素在一定程度上逆转了这一作用。

葛根素；视网膜色素上皮；转化生长因子-β2；极低频电磁场；近视

近视眼发病机制和防治的研究一直是眼科领域的研究热点，目前已公认近视眼的发生是在视网膜调控下巩膜主动重塑的结果。视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）有多种影响视网膜-巩膜信号系统的因子，并参与调控巩膜组织的重塑过程，被认为是视网膜信号传递至效应器巩膜必不可少的中间环节〔1〕。本课题组长期从事极低频电磁辐射（extremely low frequency electromagnetic fields，ELF-EMFs）与近视关系的研究，发现辐射导致豚鼠眼轴延长，近视屈光度增加，RPE细胞增殖活性下降，形态发生不规则改变，细胞中转化生长因子-β2（transforming growth factor-β2，TGF-β2）明显增高，RPE细胞上清作用于巩膜细胞，后者的基质金属蛋白酶增高，Ⅰ型胶原下降，而Ⅰ型胶原的变性和减少所导致的后极部巩膜薄弱是轴性近视的特征之一，因此我们提出ELF-EMFs可能通过造成RPE细胞病理改变，影响TGF-β2的合成与分泌，从而促成巩膜病理性重塑〔2-5〕。葛根素作为传统中药活性单体，对多种致病因素引起的机体病理变化具有保护作用，葛根素对RPE细胞凋亡，视网膜变性，糖尿病视网膜病变及视网膜缺血／再灌注损伤的保护作用已有报道〔6-9〕。对电磁辐射引起的RPE病理变化是否有保护作用鲜有报道。此次实验通过观察葛根素对受极低频电磁辐射的RPE细胞的保护作用探讨葛根素对近视的可能防治作用。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM-F12培养基、胎牛血清、0.25胰蛋白酶、青霉素-链霉素（美国Gibco公司）；葛根素（110752-201313，中国药品生物制品检定所）；CCK-8试剂盒（日本Dojindo公司）；Real-Time PCR试剂盒（美国BIO-RAD公司）；TGF-β2引物（上海生工生物技术公司）；ELISA试剂盒（上海碧云天公司）；电磁辐射分析仪TES-1393（台湾泰仕公司）。

1.2 ELF-EMFs辐射系统的建立

自制磁场辐照系统，由周长60 cm、高度8 cm、168匝的Helmholtz线圈和变压器构成，其中3个线圈相互串联后叠放并与细胞培养箱外的变压器相连。用变压器调节线圈内电压大小，使3个线圈的空间区域产生一个恒定、均匀的50 Hz正弦磁场辐照区，该辐射系统所产生的磁场用电磁辐射分析仪测定。在细胞受磁场辐照时，培养皿中心位于辐照系统的中心轴上。见图1。

图1 电磁辐射系统示意图。3个线圈相互串联

1.3 细胞培养及分组

人视网膜色素上皮细胞系（ARPE19）购自美国模式培养物集存库（American type culture collection， ATCC），用DMEM-F12培养液（含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素）在37℃，体积分数5%CO2的培养箱中培养，每48 h更换新鲜培养液，待细胞融合长满瓶底80%左右，按1∶3比例消化传代。每次实验均取自同一批传代细胞，待细胞全部贴壁后更换新鲜培养基分组培养，葛根素组加入终浓度为100 μmol/L的葛根素。辐射组与葛根素组的细胞置于0.2 mT，50 Hz的电磁辐射系统中，正常对照组置于同等条件未通电的相同线圈系统中培养。

1.4 CCK-8法检测RPE细胞增殖活性

RPE细胞经胰蛋白酶消化后以6×103/孔接种至96孔板，并将细胞悬液分为对照组，辐射组，葛根素组，每组每个时间点均设置4个复孔。培养12 h后，更换新鲜培养基，辐射组与葛根素组放置于0.2 mT的ELF-EMFs中辐射，对照组放置于未通电的辐射箱内。在培养6、12、24、48 h后，每孔加入10 μl的CCK-8试剂，继续培养2 h后，酶标仪波长450 nm测定光密度D（450 nm），计算每组D（450 nm）的平均值。

1.5 Real-time PCR检测RPE中TGF-β2 mRNA表达水平

每组细胞各自培养24 h后，用Trizol试剂抽提RPE细胞中RNA，用逆转录试剂盒进行逆转录反应，TGF-β2及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物TGF-β2 F：5’GGG TGG AAA TGG ATA CAC GAA C 3’；TGF-β2 R：5’GGG TGT TTT GCC AAT GTA GTA GAG 3’；GAPDH F：5’GGA GTC CAC TGG CGT CTT C 3’；GAPDH R：5’GCT GAT GAT CTT GAG GCT GTT G 3’。引物由上海生工生物技术公司合成，所有PCR反应由PCR仪完成，GAPDH为内参，计算各组相对定量值（RQ值）。

1.6 ELISA检测RPE细胞上清中TGF-β2的含量

将5×105的RPE细胞种植在25 mm2培养瓶中，用不含胎牛血清的DMEM-F12培养基进行分组培养24 h后，将细胞上清转移到浓缩管中，放置到低温离心机中，4 000 r/min离心25 min，收集浓缩好的上清根据ELISA试剂盒说明检测TGF-β2的含量（pg/ml）。

1.7 统计学方法

实验研究数据采用SPSS 17.0对结果进行处理，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示。各组不同时间点RPE细胞增殖活性[D（450 nm）]比较采用重复测量资料的方差分析，RPE细胞中TGF-β2 mRNA相对表达及细胞上清中TGF-β2的含量比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RPE细胞增殖活性的变化

CCK-8检测结果显示，各组RPE细胞不同时间点的增值活性差异不同（重复测量资料的方差分析，F分组=398.493，P<0.01；F时间=2266.539，P<0.01；F交互作用= 25.485，P<0.01）。6 h时各组光密度值接近（P＞0.05）；12h、24h、48h时葛根素组光密度值低于对照组（12h：P＞0.05；24 h、48 h：P<0.01），高于辐射组（12 h：P<0.05；24 h、48 h：P<0.01），该组间差异有随时间的延长逐渐加大的趋势（表1，图2）。提示ELF-EMFs能抑制RPE细胞增殖活性，而葛根素可以减弱这种抑制作用。

表1 CCK-8法检测各组RPE细胞不同时间点的增殖活性比较±s，D（450 nm）]

表1 CCK-8法检测各组RPE细胞不同时间点的增殖活性比较±s，D（450 nm）]

注：重复测量资料的方差分析，F分组=398.493，P<0.01；F时间=2 266.539，P<0.01；F交互作用=25.485，P<0.01。12 h与对照组比较，①P<0.01，与辐射组比较，②P<0.05；24 h与对照组比较，③P<0.01，与辐射组比较，④P<0.01；48 h与对照组比较，⑤P<0.01，与辐射组比较，⑥P<0.01

各时间点的光密度值6 h12 h24 h48 h对照组40.6150±0.03081.0015±0.03961.7350±0.02282.2940±0.0635辐射组40.6130±0.01450.9258±0.0252①1.4498±0.0547③1.7780±0.0599⑤葛根素组40.6175±0.03590.9748±0.0138②1.6200±0.0294③④2.0125±0.0608⑤⑥组别样本量

图2 CCK-8法检测各组RPE细胞的光密度值-时间折线图RPE：视网膜色素上皮

2.2 RPE细胞中TGF-β2 mRNA表达水平

对照组、辐射组及葛根素组RPE细胞中TGF-β2 mRNA/GAPDH mRNA的相对表达量分别为（45.83±5.74）×10-3，（97.33±7.34）×10-3，（68.33±6.06）× 10-3，3组差异有统计学意义（F=97.154，P<0.01）。辐射组TGF-β2 mRNA表达水平较对照组上调了112.36%（P<0.01），葛根素组TGF-β2 mRNA表达水平较辐射组下调了29.80%（P<0.01）。葛根素组与对照组相比，TGF-β2 mRNA表达水平上调了49.09%（P<0.01）。见图3。

2.3 RPE细胞上清中TGF-β2的含量

对照组、辐射组及葛根素组RPE细胞上清中TGF-β2的蛋白含量分别为（461.83±35.80）pg/ml，（1329.28±55.03）pg/ml，（798.06±22.52）pg/ml，3组差异有统计学意义（F=714.74，P<0.01）。辐射组较对照组RPE细胞上清中TGF-β2含量增高187.83%（P<0.01），葛根素组较辐射组RPE细胞上清中TGF-β2含量降低39.96%（P<0.01）。葛根素组与对照组相比，RPE细胞上清中TGF-β2含量增高72.81%（P< 0.01）。见图4。

图3 Real-time PCR检测各组RPE细胞TGF-β2 mRNA相对表达（TGF-β2 mRNA/GAPDH mRNA）。3组比较，F=97.154，P<0.01；各组两两比较，均为P＜0.01（单因素方差分析，LSD法）RPE：视网膜色素上皮TGF-β2：转化生长因子-β2GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

3 讨论

近视眼发病机制和防治的研究一直是眼科领域的研究热点。目前已公认近视眼的发生是在视网膜调控下巩膜主动重塑的结果。在近视眼形成过程中，RPE细胞不仅结构发生显著变化，还可以传递视网膜的近视信号，影响巩膜重塑，从而调节近视的发生与发展〔1〕。TGF-β是眼球生长和巩膜重塑的重要刺激信号〔10〕。TGF-β共有5种亚型，眼部生物学活性以TGF-β2为主。研究发现，TGF-β2可储积于培养的RPE细胞上清液中〔11〕，免疫组化染色及ELISA证实RPE表达和分泌TGF-β2〔12〕。近视眼RPE脉络膜复合体中TGF-β2浓度升高，形觉剥夺诱导的近视豚鼠视网膜中TGF-β2显著增加，提示TGF-β2可能参与了近视的发生发展〔13-16〕。

我们发现极低频电磁辐射（ELF-EMFs）后RPE细胞增殖活性下降，形态发生不规则改变；TGF-β2表达和分泌明显增高，其细胞上清作用于巩膜成纤维细胞（HFSF），后者出现基质金属蛋白酶2（MMP-2）增高，Ⅰ型胶原下降，而Ⅰ型胶原的变性和减少所导致的后极部巩膜薄弱是轴性近视的特征之一，提出ELF-EMFs可能通过造成RPE细胞病理改变，影响TGF-β2的合成与分泌，从而促成巩膜的病理性重塑〔2-5〕。

关于近视的防治近年来一直徘徊不前，作为祖国医学的宝贵资源，中医药在公共卫生领域中的研究愈加重要。尤其关于中国传统医学中活性成分的单体研究已成为替代和补充医学领域的一个重要焦点。葛根素是从葛根中分离提取的一种异黄酮类化合物，是葛根主要有效成分，化学名为8-β-D-葡萄吡喃糖-4'，7-二羟基异黄酮。葛根素纯品注射液已广泛用于高血压、冠心病等的治疗。对于在整个近视发展起局部中枢性调控作用的视网膜色素上皮细胞，葛根素又有何作用值得探讨。葛根素对RPE细胞凋亡，视网膜变性，糖尿病视网膜病变及视网膜缺血/再灌注损伤的保护作用已有报道〔6-9〕。对电磁辐射引起的RPE病理变化是否有保护作用尚未见报道。

此次实验的3组细胞中，辐射组RPE细胞增殖活性较对照组降低，TGF-β2 mRNA表达增高，RPE细胞上清中TGF-β2含量上调。葛根素组较辐射组相比RPE细胞增殖活性增高，TGF-β2 mRNA表达降低，RPE细胞上清中TGF-β2含量下调，差异有统计学意义。表明葛根素可能部分逆转了ELF-EMFs造成的RPE细胞的病理改变。这将为葛根素用于防治电磁辐射对RPE的损伤以及对近视的可能防治作用提供理论依据，为进一步探讨其具体作用机制打下良好基础。

图4 ELISA检测各组RPE细胞上清中TGF-β2的含量。3组比较，F=714.74，P<0.01；各组两两比较，均为P＜0.01（单因素方差分析，LSD法）RPE：视网膜色素上皮TGF-β2：转化生长因子-β2

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Effect of puerarin on proliferative activity of human retinal pigment epithelial and transforming growth factor-β2 exposed to extremely low frequency electromagnetic fields

TIAN Tian,ZHU Huang.Ophthalmology Department,Xinhua Hospital Affiliated to School of Medicine,Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200092,China

OBJECTIVE To study the effect of puerarin on viability and transforming growth factor-beta 2（TGF-β2）in human retinal pigment epithelium（RPE）exposed to extremely low frequency electromagnetic fields（ELF-EMFs）.METHODS Experimental cells were divided into control group,radiation group and puerarin group. Proliferation rate of RPE cells were quantitated by the cell-counting kit-8 assay.TGF-β2 mRNA and secretion were measured by Real-Time PCR and ELISA analysis,respectively.RESULTS In radiation group,viability of RPE was inhibited and TGF-β2 mRNA expression was increased in contrast with control group.TGF-β2 expression in RPE supernatant was up-regulated significantly.Meanwhile,puerarin at the concentration of 100 μmol/L enhanced the viability of RPE and reduced TGF-β2 mRNA expression when compared with radiation group.TGF-β2 expression in RPE supernatant was down-regulated significantly.CONCLUSIONS ELF-EMFs changed the viability of RPE and also changed the expression and secretion of TGF-β2 in RPE.Puerarin reversed the action to some extent.

puerarin;retinal pigment epithelium;transforming growth factor-beta 2;extremely low frequency electromagnetic fields;myopia

R285

A

1002-4379（2015）06-0388-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2015.06.002

上海市卫生局中医药科研基金项目（2014JP015A）

上海交通大学医学院附属新华医院眼科，上海200092

朱煌，E-mail：drzhuhuang@163.com