DLG1基因多态性与炎症性肠病遗传易感性研究*

王静晖，许淑芳，王晓兵，刘 适，王 格，周 瑞，夏 冰

(武汉大学中南医院消化内科，湖北 武汉 430071)

炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)主要包括克罗恩病(Crohn’S，disease，CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)［1］。亚洲国家 IBD 患病率低于欧美国家［2］，但近年来IBD的发病率尤其是CD的发病率逐渐上升，且发展中国家上升趋势更为明显。西方的研究者通过大量的研究发现了一些与欧美高加索人种 IBD患者相关的易感基因，包括 NOD2/CARDl5，OCTN1，OCTN2，IL23R 等基因，但有研究表明一些与西方IBD患者相关的易感基因与中国IBD易感性无关［3，4］。我们课题组前期通过CD家系全外显子测序和生物信息学分析，发现了尚未报道的包括DLG1在内的6个候选基因单核苷酸变异可能与两个CD家系的发病有关，且DLG1基因chr3_196865242位点存在着多态性改变。这个重要发现提示chr3_196865242可能是DLG1基因中与中国人CD遗传易感性相关的SNP位点，为中国人CD发病机制的研究提供了一条重要线索［5］。目前针对DLG1多态性与IBD易感的关系研究较少，国内尚无相同报道。我们采用病例/对照研究设计和测序法进行DLG1 SNP的检测分析，探讨DLG1基因多态性与中国汉族人IBD发病的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象:共收集2012年至2013年6月临床资料完整、彼此无血源关系的中国汉族散发IBD患者345例(CD 185例，UC 160例)和健康体检者463例，以及4例CD家系(成员共15例)。IBD的诊断依据2012年中国 IBD诊断与治疗共识意见［6］，从临床表现、结肠镜检查、影像学表现、生化检查以及病理组织学检查等5个方面进行综合诊断，所有患者均排除合并其它自身免疫性疾病。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取:所有研究对象均抽取外周血，全血分离后提取基因组DNA，DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2.2 引物设计由 Primer 5.0引物设计软件设计，北京擎科新业生物技术有限公司合成。上游5’-TGCCTGGCATGTGGTTAGTG -3’;下 游 5’-GAACTTTTCAAATGCTGCAATCT-3’。

1.2.3 聚合酶链式反应(PCR扩增):25μL反应体系含 2 x PCR Tag mix 12.5μL，灭菌水 8.5μL，DNA 模板2.0μL，上游引物 1.0μL，下游引物 1.0μL。放入 PCR扩增仪，95℃预变性，5 min;进入循环:变性95℃，30 s;退火 62.3℃，30 s;延伸 72℃，40s;共 35 个循环。终末延伸72℃，7min。取PCR产物在含溴乙啶的2%琼脂糖凝胶电泳，电泳后将凝胶置于凝胶成像系统观察结果。

1.2.4 测序 PCR扩增反应结束后，短暂离心，置于4℃保存备用。经武汉擎科创新生物技术有限公司纯化并测序。

1.3 统计学方法:应用SPSS17.0统计软件进行分析，组间人群基因进行Hardy-Weinberg遗传平衡吻合度检验;χ2检验分析不同基因型在三组人群及各亚组中的构成比，同时计算比值比(OR)及其95%可信区间(CI)，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 纳入的研究对象的临床资料特征:UC患者中病变部位位于直肠30例，左半结肠50例，右半结肠18例，全结肠62例，其中男80例，女80例，平均发病年龄26.49±4.20岁;CD患者中病变部位位于小肠 70例，结肠59例，小肠合并结肠38例，直肠18例;CD按疾病的活动度分，缓解期57例，活动期128例，其中男92例，女 93 例，平均发病年龄 25.81±4.19 岁。463 例健康体检者，男296例，女167例，平均年龄39.74±12.47岁。4例CD家系(成员共15例)，男7例，女8例，平均年龄28.53±16.10岁，先证者是一名 40岁男性患者，内镜下显示病变位于回肠末端和升结肠，病检提示粘膜组织呈慢性炎，通过抗结核诊断性治疗后确诊为CD，已行氨基水杨酸制剂、免疫抑制剂和升结肠切除手术治疗。

2.2 通过DNA测序结果显示，55例散发IBD患者(其中CD 35例，UC 20例)和54例健康对照者，以及15例家系的9名亲属检测到了DLG1基因9号外显子上chr3_196865242位点G＞A的杂合突变(GA)(见图1图2)。该突变导致密码子由CGA变为CAA，所编码的氨基酸序列由精氨酸变为谷氨酰胺。所有研究样本均未发现纯合突变(AA)。经Hardy-Weinberg平衡性检验，该位点符合遗传平衡性，此样本基因频率的分布具有良好的群体代表性(P＞0.05)。

图 1 DLG1 基因突变序列图(Exon 9，c.833G.A，p.R278Q)，SNP位点的等位基因图中为绿黑色双峰

图2 DLG1基因测序的正常基因序列图片段，SNP位点的等位基因图中为黑色单峰

2.2.1 DLG1 基因 chr3_196865242 位点多态性基因型频率与IBD的相关性分析(表1):散发CD组GA基因型者所占比例为18.9%，与健康对照组(11.7%)相比，P＜0.05，差异有显著意义;散发UC组GA基因型者所占比例为 12.5%，与健康对照组(11.7%)相比，P＞0.05，无统计学差异;家系组 GA基因型者所占比例60%，与健康对照组(11.7%)相比，P＜0.05，差异有显著意义。④散发UC组、散发CD组和家系组相较于健康对照组的 OR 值分别为 1.082、1.767 和 11.361;散发CD组和家系组与健康对照组相比时，差异均有统计学意义，P 值分别为 P＜0.05 和 P＜0.001。

3 讨 论

目前的观点认为，IBD是携带遗传易感基因的宿主在环境因素作用下，自身免疫功能紊乱导致的一种非特异性炎症性疾病［7，8］。CD病变呈阶段性或跳跃式分布，为全层肠壁性炎症，多见于回肠末端和近端结肠［9，10］;UC病变主要累及大肠粘膜和粘膜下层，多见于直肠和远端结肠，严重时也可累及全结肠及末端回肠［11］。炎症性肠病患者常伴随着自主神经功能的紊乱，在其死因中，癌变占到近10%～15%的比例，对患者的生存质量有很大影响［12～14］。众多研究显示，炎症性肠病存在明显家族聚集现象和人种差异性，更易发生在家族成员中，而且患者一级亲属的发病危险性更高，发病年龄更早［15，16］。单卵双生子比双卵双生子有更高的疾病一致率［17］，单卵双生子中，CD和UC的发病一致率分别为20%～44%和6%～10%;双卵双生子CD和UC的发病一致率分别为3.8%～6.5%和3%。据统计UC患者同胞患病的危险性提高7～17倍，而CD 患者同胞患病的危险性更甚，可达 13～36 倍［18，19］。欧美一些研究也显示CD的一些临床表现如狭窄、窦道形成和炎症程度等与遗传因素相关，并发现IBD家族中病变累及部位与有无肠外病变有高度一致性。诸多研究证明IBD特别是CD具有明显的遗传易感性［20］。

DLG1基因包含有3个PDZ结构域，每个PDZ由约90个氨基酸组成，能够通过特异性识别配体蛋白C末端的氨基酸残基介导蛋白质之间的相互作用，并通过PDZ区与其他分子相互作用参与微管极化，中心体再定向以及细胞迁移，对细胞的信号传导和增殖、突触发育和淋巴细胞活化可能发挥重要的作用。有研究表明DLG1在记忆T细胞生成，T细胞极性以及T细胞受体信号的特异性中发挥作用［21，22］。而T细胞与自身免疫性疾病密切相关，大量研究结果显示T细胞迁移进入肠道，参与肠道炎症的发生和组织破坏［23，24］。另外，DLG1基因的缺失也会导致致瘤性细胞因子如IL-6和TNF-α等对机体的侵袭［25］，其存在突变时，会出现微丝和微管的异常组装而导致的细胞极性异常，柱状上皮细胞去极化和细胞粘附分子的异常分布，以及导致细胞极性的丧失和细胞的过度增殖［26］。

我们应用MassARRAY基因质谱和外显子组测序技术筛选和验证了IBD的易感基因，筛查出尚未报道的THBS1，KLF4，SYNE1，CHD8，PDCL 和 DLG1 6个候选易感基因。课题组前期通过分析401例散发IBD患者基因型，发现了一名21岁女性CD患者携带DLG1基因突变(c.374T＞C，p.I125T)。随后对 25 例年轻顽固性CD患者进行DLG1基因全外显子组测序分析，发现两名CD患者存在DLG1基因另一位点的突变(exon 9，c.833G.A，p.R278Q)。分别对这两名CD患者家庭成员进行进一步筛查，发现其中一名程姓CD患者的一个哥哥和两个表兄妹，均在肠镜下观察到回肠末端的溃疡，病检显示为非特异性慢性炎症，最后确诊为CD。本组实验在此基础上对包括程姓CD患者在内的15名直系亲属进行基因测序，发现4名CD患者和另外5名家属存在DLG1chr3_196865242位点突变(exon 9，c.833G.A，p.R278Q)。采用病例/对照设计对DLG1基因第九外显子chr3_196865242位点进行基因多态性研究。结果显示，散发CD组和家系组OR 值分别为 1.767和 11.361，与健康对照组相比，P值分别为 0.015 和 0.000，均小于 0.05，差异有显著意义;散发UC组与健康组相比，P＞0.05，差异无统计学意义。提示在中国汉族人群中，该位点多态性可能与CD的易感性有明显相关，是决定CD个体遗传易感性的重要因素。

研究基因多态性对认识疾病易感基因、探明发病机制、评价疾病严重程度及预后有着重要意义，并可能为临床提供一种新的基因诊断方式及治疗手段。分析本次研究.实验中家系有DLG1基因突变的9人中，4人确诊为CD;随机抽样的IBD患者有DLG1基因突变的89例中，35例确诊为CD;二者之间无明显统计学差异(χ2=0.089，P=0.766)。这可能与家系实验样本量较少，偏倚较大，限制了很多分析进行有关，同时，也不排除存在抽样误差的可能，和多重检验可能造成的阴性结果。因此，我们不能简单地定义该基因突变与CD发生风险的相关性。需要扩大样本量，采用多中心、标准化的研究方法.做进一步的研究，从而为阐明IBD的病因、基因治疗、遗传咨询以及易感人群的合理防治等提供依据。

表1 各组间chr3_196865242位点多态性χ2检验

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