组织工程牙髓再生的研究进展

王冠华

天津市口腔医院暨南开大学口腔医院中心实验室　300041

组织工程牙髓再生的研究进展

王冠华

天津市口腔医院暨南开大学口腔医院中心实验室300041

摘要龋病、牙髓病是普遍危害人类健康的疾病，目前临床主要采用树脂充填或根管治疗方法。尽管上述治疗方法均能一定程度的恢复牙齿解剖形态及功能，但是无法替代有正常功能的牙髓组织，导致牙齿失去营养容易变脆劈裂，最终造成牙齿的缺失。随着组织工程技术的广泛应用，组织工程牙髓再生逐渐得到发展和重视。本文系统回顾了牙髓组织工程研究进展，包括种子细胞、生长因子及用于牙髓组织工程的常用支架材料等内容。

关键词组织工程牙髓干细胞牙髓再生

龋病是人类发病率最高的疾病之一，如果未得到有效的治疗，就会发展为牙髓病以及根尖周疾病。目前对于牙髓和根尖周疾病主要的治疗方法是根管治疗。虽然根管充填材料具有良好的生物相容性，但是依然无法替代有正常功能的牙髓组织，无法对牙齿起到滋养、修复等作用[1]。失去牙髓的牙齿更容易发生再感染和牙齿劈裂，从而进一步造成牙齿缺失[2]，因此，需要有新的治疗手段避免牙齿的丧失。随着组织工程技术的广泛应用，牙髓再生成为新的治疗手段，它能够替代损伤的牙髓组织行使功能[3]。

1种子细胞

干细胞是一类具有自我复制和多向分化潜能的细胞，它在不同环境的作用种子细胞、理想的支架材料以及相应的生长因子是牙髓组织工程现代理念中的三大关键要素[4]，本文就上述关键因素进行介绍。牙髓干细胞(Dental pulp stem cells,DPSCs)是一种存在于牙髓组织中的成体干细胞，由Gronthos 首次提出，主要是从牙髓细胞中分离得到的间充质干细胞[1]。Gronthos 利用酶消化法，从健康的人第三磨牙牙髓中分离得到牙髓干细胞[5]，它的免疫表型与间充质干细胞相似。牙髓干细胞的形态类似人骨髓成纤维细胞，大多数细胞呈长梭形，体积较小[6]。而乳牙牙髓干细胞是分离培养自脱落乳牙的干细胞[7]，其形态呈多形性，大部分呈梭形，体积较小，轮廓清楚[8]，由此可见成人牙髓干细胞与乳牙牙髓干细胞形态有很多相似之处。

牙髓干细胞具有多种生物学特性。Couble 等将从健康人牙髓中分离提取的牙髓细胞中加入磷酸甘油进行诱导分化后形成复合体，这些细胞还能够分泌富含Ⅰ型胶原的基质并矿化[9]，这些都能证实了牙髓干细胞具有成牙本质分化能力。有文章指出牙髓干细胞的表面标记物与间充质干细胞相似，包括Stro-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD146和CD166等的表达都与间充质干细胞相似[10]。另外它作为干细胞同样具有多向分化潜能，在培养过程中添加一定的诱导剂后，具有向成骨、神经、肌肉、脂肪等细胞分化的能力。同时，体外培养的牙髓干细胞比骨髓间充质干细胞具有更高的克隆形成能力，它的增殖速度是骨髓间充质干细胞的30～50倍[11]。这些都充分说明了牙髓干细胞作为组织工程种子细胞具有很多优越性，因此它在牙髓组织工程再生中具有良好的应用前景。乳牙牙髓干细胞作为干细胞也同样具有成骨、神经、肌肉、脂肪等细胞分化的能力[12]。研究还证实乳牙牙髓干细胞在阳性表达和多向分化性方面与牙髓干细胞相似，如成骨性和成脂性[13]。另外有文章指出流式细胞仪检测显示乳牙牙髓干细胞CD29、CD73和CD146呈阳性表达[14]。这在很大程度上说明了牙髓干细胞和乳牙牙髓干细胞具有很多相同的生物学特性，它们均能作为种子细胞用于牙髓组织工程再生。但从组织来源上看，与成人牙髓干细胞相比，脱落乳牙来源容易而且无创伤，且组织来源更加年轻，细胞活性更加良好。因此它更加适合作为组织工程牙髓再生的种子细胞。

牙髓干细胞和乳牙牙髓干细胞的分离方法比较简单，目前通常应用组织块法和酶消化法获得牙髓干细胞和脱落乳牙干细胞。采用免疫磁珠分选系统分离得到干细胞，具体原理是通过应用包被抗小鼠IgM MicroBeads的免疫磁珠，将牙髓干细胞的磁性标记分选柱移出磁场后，洗脱滞留柱内的细胞，从而获得牙髓干细胞[15]。由于乳牙牙髓干细胞与成人牙髓干细胞具有很多相似的生物学特性因此可以采用相同的方法得到脱落乳牙的牙髓干细胞。另外也可以应用流式细胞仪进行干细胞的分选，但相较于免疫磁珠分选系统，流式细胞仪分选得到的干细胞量相对较少。

2生长因子

信号因子的主要作用是诱导干细胞分化，目前促干细胞生长的信号因子主要是骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMP)、转化生长因子(Transforming growth factor,TGF-β)、碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,b-FGF)以及白细胞介素等。作为干细胞中的一种牙髓干细胞同样也受到信号因子的影响。有学者向牙髓干细胞中转入BMP-7基因，并在无矿化诱导的情况下进行细胞培养，结果证明加入人类BMP-7基因的牙髓干细胞有向成牙本质细胞分化的能力和较强的硬组织形成能力[16]。另外也有文章指出基因重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子G-CSF能够促进牙髓干细胞进行牙髓重建[17]。b-FGF是成纤维细胞生长因子家族中的一员,在体外能刺激细胞增殖、迁移，且对细胞有丝分裂和增殖具有较强促进作用，同时也能够参与调控组织血管化、组织损伤修复等。有研究报道显示b-FGF可以明显促进牙髓干细胞的体外扩增速率、克隆形成能力及细胞迁移能力[16]，充分说明了在牙髓干细胞增殖和分化的过程中BMP和b-FGF都起到了非常重要的作用。另外巨噬细胞集落刺激因子G-CSF也对牙髓干细胞增殖具有促进作用，在进行牙髓干细胞培养和牙髓组织工程再生的过程中可以适当添加相应的生长因子，促进细胞生长和组织再生。另外还有一些其他的细胞因子对牙髓干细胞增殖有影响，如早期炎症相关细胞因子：肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosisfactor-α，TNF-α)、白细胞介素(IL-1β、IL-6、IL-10)等都对牙髓干细胞的增殖分化有一定的影响。有学者从炎症牙髓中检测出TNF-α高表达，证实其直接参与并加重牙髓炎的进展。也有研究发现TNF-α可以促进牙髓干细胞向成牙细胞分化[16]。目前关于牙髓干细胞生物学性能影响因素的研究很多，有很多生长因子都参与到牙髓干细胞的增殖和分化的过程中，这需要进一步的研究探讨寻找更适合DPSCs生长的环境。

3支架材料

作为组织工程牙髓的三大关键要素之一，支架材料在牙髓再生中也发挥着非常重要的作用。随着口腔组织工程再生的逐渐发展，应用于口腔组织的工程材料也随之发展。作为支架材料需要具有以下基本特点：无毒性，任何组织工程材料应用的最终目的都是植入人体，因此不能有毒性；有良好的生物相容性，不能引起周围组织发生严重的炎性反应而影响细胞增殖；可降解性，植入机体内的支架材料应能被周围组织吸收而其降解率宜与再生组织的形成速率保持一致；有合适的孔隙率，以利于细胞生长并传递营养和代谢产物等[18]。总之组织工程支架材料都必须符合人体的生长环境，以便其在功能上能够代替正常的人体组织。

目前应用于牙髓组织工程的材料包括聚乳酸、聚羟基乙酸和二者共聚物、藻酸盐、胶原、羟基磷灰石、磷酸三钙、自组装多肽等。国内有学者将壳聚糖与磷酸三钙组合成一种新的三维多孔结构复合材料, 使其具有良好的机械强度及韧性,且磷酸三钙降解产物呈碱性能够中和壳聚糖所产生的酸性物质,因此能够减轻炎症反应[19]。李景辉等将牙髓细胞与明胶材料复合培养并植入裸鼠体内4周后，有骨组织形成[20]。另外，血小板自身含有生长因子，目前富血小板血浆(Platelet-rich plasma，PRP)已经是非常重要的组织工程材料。PRP临床上广泛用于促进骨组织再生、创伤修复、牙周组织再生以及牙种植体骨愈合等多个领域[21]。随着对PRP研究的不断深入，它的应用也越来越广泛，国内有学者将小型猪的牙髓细胞与提取的不同浓度的PRP进行复合培养，结果显示10% PRP凝胶具有良好的可塑性以及富含生长因子的特性[22]。刘中宁等将PRP和第4代DPSCs复合激活后，植入雌性裸鼠背部皮下， 4周、8周后观察到裸鼠皮下有白色生成物，单独植入DPCs或PRP组未见生成物[23]。由此可见PRP作为牙髓组织工程的材料具有良好的应用前景，PRP不仅对牙髓细胞的增殖有促进作用，而且来源容易，可以应用患者本人外周血进行分离提取，从而降低了植入后的不良反应和组织排异。文军等将改良的PRP按照不同浓度加入到培养的牙髓细胞中，2%改良富血小板血浆可以促进乳牙牙髓干细胞的增殖[24]，这在PRP浓度选择上给了我们一些启示。总之，上述相关研究都为PRP作为牙髓组织工程材料的研究奠定了工作基础，且由于PRP其自身的特点其进一步应用于临床也有很大的希望。

虽然，目前临床治疗牙体牙髓疾病的手段不断更新，但仍然无法治疗所有的疾病，有很多患者最终仍然丧失了牙齿。组织工程牙髓再生为解决这一难题提供了新的思路，但由于组织工程牙髓再生还处于发展阶段，因此仍然有很多需要解决的问题，包括如何获取稳定可靠的种子细胞，如何选择和研发适合组织工程牙髓的支架材料以及促进细胞增殖的生长因子的研究等。但随着组织工程学科的逐步发展，上述问题都能够得到解决，因此组织工程牙髓再生在治疗牙体牙髓疾病的应用中将会有良好的前景。

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(编辑落落)

◎致作者◎

统计学符号的书写

收稿日期2015-05-20

中图分类号：R783

文献标识码：A

文章编号：1001-7585(2015)20-2750-03