香蕉束顶病毒(BBTV)的快速提取检测方法

江　沄， 孙　薇， 张煜隆,2， 刘小娟,2

(1.福建农林大学植物保护学院， 福建 福州 350002；

2.福建省植物病毒学重点实验室， 福建 福州 350002)

香蕉束顶病毒(BBTV)的快速提取检测方法

江沄1， 孙薇1， 张煜隆1,2， 刘小娟1,2

(1.福建农林大学植物保护学院， 福建 福州 350002；

2.福建省植物病毒学重点实验室， 福建 福州 350002)

摘要:香蕉束顶病毒(Banana Bunchy Top Virus，BBTV)是香蕉上一种危害严重但又难以防治的病毒。目前只能通过及时铲除染病植株来控制传播，因此快速有效的病毒检测技术是防治BBTV的关键。BBTV为单链环状DNA病毒，本试验采用优化后的DNA提取方法提取感病的香蕉样品的DNA，并用特异性引物对提取产物进行PCR检测。结果显示本试验优化的方法操作方便、用时短，并且提取产物能够用于BBTV快速检测，从而为BBTV的快速检测提供新的方法。

关键词:香蕉束顶病毒； DNA提取； 快速检测

香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus，BBTV)是香蕉生产中的一个最严重的病毒，由它引起的香蕉束顶病威胁着世界上25%的香蕉种植区(Dale，1987)，感染BBTV的香蕉果实小而且少，甚至不能结实，该病发生严重的地区香蕉生产通常无利可图。香蕉束顶病毒是单链环状DNA病毒，目前一致认为，BBTV为18-20 nm等轴的二十面体结构，基因组至少是由6个大小约1.0-1.1 kb的环状ssDNA组分组成，分别命名1、2、3、4、5、6组份(Hardingetal，1991)，都由编码区和非编码区两部分构成(Xieetal，1995；Beethametal，1999；Burnsetal，1995)。

香蕉主要通过组培技术进行无性繁殖，一旦种苗带毒，香蕉病毒的传播和危害就会加剧。种植区一旦有毒株应该及时清除，否则发病植株会成为病源使病毒在整个种植区蔓延。因此，快速有效的BBTV检测技术是防治BBTV的关键。目前，国内检测香蕉病毒的方法主要有酶联免疫吸附测定(ELISA)法(范国成等，1999)、PCR法(周莉娟等，2001)及免疫PCR等，国外有利用多重免疫捕捉PCR检测香蕉病毒病的报道。一些植物病毒的检测用到的胶体金免疫层析试纸条法虽然操作方便、反应灵敏，但目前还没有研发用于检测BBTV的试纸条。

由于香蕉叶片富含多酚、多糖等次生代谢物，因此使用普通的DNA提取方法很难将其基因组DNA分离纯化。目前提取富含多酚多糖的香蕉DNA的方法有基于SDS基础上的改良方法(柴娟等，2014)；SDS、CTAB和PVP法(杜道林等，2003)；Paterson等人在1993年提出的以多酚物质棉花为材料的DNA提取方法等。

为了提高检测香蕉束顶病的效率，本试验通过优化DNA的提取方法，建立了一种快速且操作方便的香蕉束顶病的检测方法，为生产实践提供有力的技术保障。

1 试验材料

1.1试验试剂

根据本实验室人员研发的专利申报号为：201410492569的快速无毒DNA提取方法进行优化改进后开发的北京德曼特尔生物科技有限公司快速无毒植物基因组DNA提取试剂盒、10×Loading bufer购自宝生物工程(大连)有限公司、2×Es Taq Master Mix 购自北京康为世纪生物科技有限公司、引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2试验仪器

5417R 台式离心机(Eppendorf)、T3000 PCR 热循环仪(Biometra)、DYY-6C 电泳仪、GeneGenius 凝胶成像系统、核酸蛋白测定仪(Eppendorf) 、DK-8D 电热恒温水槽等。

1.3样品

香蕉病株及香蕉键株。

2试验方法

2.1模板DNA的提取

本试验中DNA的提取皆使用购自北京德曼特尔生物科技有限公司快速无毒植物基因组DNA提取试剂盒，并根据香蕉样品的特性，对提取过程进行优化。

具体操作步骤如下：

(1)将洗脱缓冲液EB和缓冲液PL1在65 ℃水浴锅中预热。

(2)将200 μL柱处理液CL加入DNA吸附柱SC，10 000 rpm室温离心1 min，弃废液。

(3)取一定重量的样品剪碎后放入2mL离心管，并加入灭过菌的4 mm小钢珠2粒。将样品用液氮速冻后放入铝盒中上下晃动10 s。重复4-6次至植物组织成粉末状。(注：若样品打成粉末状后没有马上加缓冲液PL1，则需将样品放置于4 ℃冰箱中保存，以免影响提取效果。)

(4)加入100 μL 65 ℃预热的缓冲液PL1，室温放置2-3 min，期间不断上下颠倒混匀数次，保证缓冲液PL1充分浸润样品。

(5)加入600 μL缓冲液PL2，室温放置2-3 min，期间不断上下颠倒混匀数次。

(6)用磁铁吸出离心管内的钢珠，10 000 rpm室温离心1 min。

(7)转移上清液到步骤2处理过的DNA吸附柱SC中，10 000 rpm室温离心1 min，弃废液。

(8) 往DNA吸附柱SC中加入300 μL缓冲液PL2 ，10 000 rpm室温离心1 min，弃废液。

(9) 往DNA吸附柱SC中加入650 μL漂洗液WB ，10 000 rpm室温离心1 min，弃废液。

(10)10 000 rpm室温离心1 min。

(11)把DNA吸附柱SC转移到新的1.5 mL离心管中，开盖，室温放置2 min，加入30 μL预热的洗脱缓冲液EB，静置2 min。

(12) 洗脱DNA，12 000 rpm室温离心1 min。

2.2PCR检测

用2.1中方法提取出的带病香蕉总DNA为模板，采用谭小勇等(2010)的 BBTV检测引物P1：ATGTGGTATGCTGGATGTTC ，P2 ：GTTCATATTTCCCGCTTTGA 进行PCR检测，反应体系为：DNA模板2 μL 、P1和P2各1 μL 、 2×Es Taq Master Mix 10 μL 、RNase-free ddH2O 6 μL 。PCR反应程序为：预变性94 ℃ 6 min、变性94 ℃ 35 s、退火56 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 38 s，运行35个循环后， 72 ℃ 10 min终延伸，16 ℃保存。

3试验结果

3.1香蕉组织基因组DNA提取结果

使用优化后的快速无毒植物基因组DNA提取方法提取20mg、30mg、50mg、70mg、100mg新鲜香蕉叶片,取10μL电泳结果如图1所示,浓度及OD值如表1所示。电泳图显示不同样品的泳道都有清晰的基因组DNA条带,OD值结果显示提取产物的浓度和纯度都比较高,说明本文使用的DNA提取方法能有效的提取香蕉的DNA。SDS、CTAB和PVP法中SDS法提取量最大(杜道林等，2003)。因此将SDS法提取的香蕉叶片DNA同本试验优化的DNA提取方法所提取的香蕉叶片DNA作比较，取10 μL电泳结果如图2所示。可见本试验优化的方法提取的DNA电泳条带要比SDS法提取的DNA亮，说明本文的DNA提取效果要好于SDS法的提取效果。

表1 不同重量香蕉样品DNA提取结果Table1 DNAextractionresultsofdifferentweightbananasamples样品重量浓度(ng/μL)OD值20mg108.11.9730mg121.11.9950mg135.81.8470mg124.32.02100mg160.82.01

3.2PCR检测BBTV

根据3.1中的提取结果显示，重量为50 mg的香蕉叶提取效果最好，根据实际操作情况，50 mg的量的香蕉叶在试验操作中最为方便，因此在本试验PCR检测中使用50 mg的量提取DNA作为模板进行检测。

染病植株新鲜叶片、新鲜茎秆、枯萎叶片、枯萎茎秆PCR检测结果如图3所示。由于枯叶、枯杆较鲜叶、鲜杆水分散失较多，因此在取样时只需取同50 mg的鲜叶或鲜杆面积相同即可。

图1不同重量香蕉样品DNA提取的凝胶电泳 图2两种方法DNA提取的凝胶电泳

Figure 1Gel electrophoresis of DNA extraction of Figure 2Gel electrophoresis of DNA

different weight banana samples extraction by two methods

M.DNA Marker III； 1-5.重量分别为20 mg、30 mg、 M.DNA Marker III；1、2.SDS法提取的香蕉叶片DNA；

50 mg、70 mg、100 mg新鲜香蕉叶片DNA 3、4.本试验方法提取的香蕉叶片DNA

图3　PCR产物的凝胶电泳Figure 3　Gel electrophoresis of PCR products1、2.新鲜叶片PCR产物； 3、4.新鲜茎秆PCR产物；5、6.枯萎叶片PCR产物； 7、8.枯萎茎秆PCR产物

图4　不同模板的PCR的凝胶电泳Figure 4　Gel electrophoresis of PCR with different templatesM.DNA Marker III； 1-3.模板为SDS法提取的染病香蕉叶片DNA； 4-6.模板为SDS法提取的健康香蕉叶片DNA； 7-9.模板为本文的DNA提取方法提取的染病香蕉叶片DNA； 10-12.模板为本文的DNA提取方法提取的健康香蕉叶片DNA

用SDS法和本文的DNA提取方法提取染病香蕉叶片DNA和健康香蕉叶片DNA，并以之为模板进行PCR，对比结果如图4所示。可见两种方法的PCR结果基本一致，并且以本文的DNA提取方法提取的DNA为模板的PCR电泳条带要稍亮一些，说明本文优化的DNA提取方法能够提取出质量好的香蕉DNA。

4结果分析

优化后的快速无毒植物基因组DNA提取方法提取出的香蕉基因组DNA经过电泳后，条带清晰；从表1的数据来看，五个样品的浓度都超过100 ng/μl，OD值几乎都在1.8-2.0之间，或是极为接近这一区间，这样的试验结果说明此方法提取效率很高同时提取质量还很好。

使用优化后的快速无毒植物基因组DNA提取方法提取出的香蕉基因组DNA作为模板进行的PCR结果也十分理想，不仅得到了大小一致的条带，而且条带清晰，尤其是新鲜叶片和新鲜茎秆的结果十分理想，而枯萎叶片和枯萎茎秆的条带没有新鲜的亮，但也大小正确，同样能都检测出植株带病。

5讨论

由于BBTV没有具体的治疗方法，且危害不同的国家地区，危害范围广，造成了极大的经济损失。目前BBTV的预防方法主要是通过组培技术生产无毒种苗。及时清除种植区的毒株，防止发病植株成为病源使病毒在整个种植区蔓延。因而快速、有效并准确的检测出BBTV在生产实践中非常重要。本试验就是在此背景下优化出一种快速、有效、且准确的检测方法。

本试验在DNA的提取上采用了快速无毒植物基因组DNA提取试剂盒的方法，同时在试验过程中针对香蕉的植物学特性对其中的一些操作进行了合理的优化，比如：在打碎样品时不能让样品离开液氮在铝盒中晃动太久，否则温度升高，样品中的多酚多糖等物质会影响DNA的提取质量。因此缩短单次打碎样品的时间，提高打碎样品的次数。同样，若打成粉末状的样品不能及时进行后续步骤，也应低温保存；加入缓冲液PL1后多放置一分钟左右，使其裂解更为充分；加入600 μL缓冲液PL2后多放置1 min左右，能够更加充分的去除多酚多糖等。从而使该DNA提取方法更适合香蕉基因组DNA的提取。

在传统的检测方法中，ELISA使用的抗体本质是蛋白质，香蕉中所含的单宁会使蛋白质变性，从而在很大程度上影响试验结果，降低准确性；PCR检测离不开的DNA需要从香蕉中提取出来。普通的DNA提取方法很难从富含多酚多糖的香蕉中提取出DNA，相对来说提取效果较好的SDS法、CTAB法也存在高毒、耗费时间长、液氮研磨易交叉污染等缺陷。本试验中采用并优化的快速无毒植物基因组DNA提取方法经过试验证明有如下几个优点：一是能很好的克服多酚多糖的干扰提取出高质量的香蕉基因组DNA；二是本方法使用的是2 mL离心管配合钢珠打碎样品，可以很好的避免液氮研磨交叉污染的问题；三是能在香蕉枯萎的叶片和茎秆中提取出基因组DNA，并且能够进行PCR检测。而感染BBTV植株会出现枯死症状，那么通过枯死的部位也能够进行检测；四是试验步骤简单、耗时短、效率高。

本试验优化的快速提取检测香蕉束顶病的方法通过试验证明能够快速、有效、且准确的提取并检测出香蕉束顶病。

参考文献

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(责任编辑：陈晓雯)

江沄，孙薇，张煜隆，刘小娟.2015.香蕉束顶病毒(BBTV)的快速提取检测方法.武夷科学，31：170-175.

A rapid method for extraction and detection of

Banana Bunchy Top Virus (BBTV)

Yun JIANG1， Wei SUN1， Yu-Long ZHANG1,2， Xiao-Juan LIU1,2

(1.CollegeofPlantProtection,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China;

2.FujianProvincalKeyLaboratoryofPlantVirology,Fuzhou,Fujian350002,China)

Abstract:Banana Bunchy Top Virus (BBTV)is a serious and difficult-treating virus in banana. The best way to control BBTV is rooting out virus-effected plants, and detecting the virus rapidly and efficiently becomes very important. BBTV is a single stranded ring DNA virus. In this experiment DNA of banana samples was extracted by a optimized method, and then detection of BBTV by PCR . The results showed that the method optimized is easy to be operated with short time, and the extracted products can be used for the rapid detection of BBTV, which provides a new method for the rapid detection of BBTV.

Key words:Banana Bunchy Top Virus (BBTV); DNA extraction; rapid detection

中图分类号:Q781

文献标识码:A

文章编号：1001-4276-(2015)01-0170-06

作者简介：江沄(1994-)，女，学士。Email：243002689@qq.com。

基金项目：福建省自然科学 (2010J01073)。

收稿日期：2015-03-03; 发表日期：2015-10-31