马铃薯ARF基因RNAi载体的遗传转化及对其试管薯生理特性的影响

裴瑞芳，刘英，刘柏林，张宁，司怀军*，王蒂*

(1.甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃省干旱生境作物学省部共建国家重点实验室培育基地，

甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070)

马铃薯ARF基因RNAi载体的遗传转化及对其试管薯生理特性的影响

裴瑞芳1,2，刘英1,2，刘柏林1，张宁2，司怀军1,2*，王蒂1*

(1.甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃省干旱生境作物学省部共建国家重点实验室培育基地，

甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070)

摘要：用含有ADP核糖基化因子(ARF)基因的干扰载体的农杆菌转化马铃薯栽培品种“甘农薯2号”，获得转化植株48株，经卡那霉素抗性筛选和PCR检测证明ARF基因已成功整合到马铃薯基因组中。用实时荧光定量PCR检测表明，转化植株中ARF基因的表达较对照均有不同程度的下降，在转基因株系Z-11和Z-12中，ARF基因表达的干扰程度分别高达92.53%和93.22%。对转基因植株诱导的试管薯的淀粉、可溶性糖、蛋白质、蔗糖和葡萄糖含量测定结果表明，与未转基因的对照相比，转基因植株的淀粉含量提高了4.29%~34.27%，蛋白质含量提高了1.47%～7.35%，可溶性糖含量提高了1.44%~17.39%；蔗糖含量提高了11.53%~53.84%，而葡萄糖含量降低了6.06%~21.21%。

关键词：马铃薯；ARF基因；干扰载体；转基因植株；生理指标

ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factor，ARF)是Ras基因超家族的成员，它们是大小约20 kDa的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，属于小G蛋白超家族中的ARF亚家族[1-2]。ARF作为霍乱毒素催化GS蛋白ADP核糖基化反应的辅助因子，于1982年被Kahn和Gilman最早发现并纯化出该类细胞因子，将其命名为ARF。人们对ARF 结构和功能的研究大部分是通过研究突变体实现的，通过突变体和天然蛋白质之间的比较可以精确了解ARF结构和功能的关系，其中最著名的是对酵母双突变体的研究。近来人们发现ARF作为磷脂酶D的激活剂[5-6]以及在酵母和哺乳动物中发现ARF是构成高尔基体转运体系的组分，认为它参与了囊泡转运过程，ARF还对蛋白质合成后的运输发挥作用并调控细胞的信号转导。ARF普遍且大量存在于真核生物细胞中，如啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、拟南芥(Arabidopsisthaliala)、果蝇(Drosophilamelanogaster)、蓝氏贾第虫(Giardialamblia)等低等生物以及鼠、牛等哺乳动物和人，其结构和功能在动植物演化发展中高度保守。目前已在哺乳动物、高等植物和真菌中克隆了多种形式的ARF基因，并对其基因结构、生理作用、表达调控作用机制进行了详细研究，随着分子生物学的发展，ARF各种基因和基因产物陆续被发现。马铃薯(Solanumtuberosum)具有产量高、营养丰富、适应性强等优良特性以及随着马铃薯产业的不断壮大和人们消费结构的变化，马铃薯品质育种工作正在受到重视。

本研究通过农杆菌介导法将组成型表达启动子CaMV 35S 驱动的ARF基因的RNA干扰表达载体导入到马铃薯栽培品种中以获得干扰植株，并对其试管薯的淀粉、蛋白质、可溶性糖、蔗糖和葡萄糖含量进行测定，以期研究ARF基因对马铃薯生理特性的影响，从而为进一步研究ARF基因在马铃薯块茎中的作用提供一定的理论基础。

1材料与方法

1.1　材料

1.1.1植物材料及试管薯的诱导2012年3月培养马铃薯栽培品种“甘农薯2号”的试管苗，在无菌条件下剪成带有2个腋芽的茎段，转接到MS(Murashige and Skoog，MS培养基)+3%蔗糖+0.45%琼脂的固体培养基上。用150 mL三角瓶培养，每瓶装50 mL固体培养基，接种5个茎段，2000 lx光照下培养，大约在3周后每个茎段生长成一株带有5～6个节的健壮试管苗，把这些健壮试管苗作为诱导试管薯的母株。试管薯的诱导采用固体诱导法，即将培养健壮的植株接入诱导培养基上，诱导培养基由MS附加8%蔗糖组成。待其培养20 d左右，将其置于黑暗、温度(23±1)℃的条件下进行马铃薯试管薯的诱导。

1.1.2菌株和质粒根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株 LBA4404由甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室提供，抗性标记为利福平(Rifampicin，Rif)；RNA干扰表达载体pHellsgatearf1(含组成型表达启动子 CaMV 35S)由刘柏林博士构建，抗性标记为卡那霉素(Kanamycin，Kan)和壮观霉素(Spectinomycin，Spe)。

1.1.3工具酶和主要试剂TaqDNA聚合酶、DNA Marker购自TaKaRa公司，引物由上海生物工程公司合成，RNA提取试剂为天根公司生产的RNA simple Total RNA Kit DP415，cDNA合成试剂为Clontech公司的SMARTer PCR cDNA Systhese Kit，Real time-PCR试剂购自TaKaRa公司的PrimeScript®RT Master Mix和SYBR®Premix Ex TaqTMII。其余生化药品分别为Sigma、Invitrogen公司产品及国产分析纯。溶液配方及常用抗生素与激素的配置详见文献[10]。

1.2　方法

1.2.1农杆菌工程菌液的制备挑取培养皿平板上含质粒pHellsgatearf1的根癌农杆菌LBA4404的单菌落，接种于30 mL LB (Luria-Bertani)培养基，含 50 mg/L 壮观霉素(Spe)+50 mg/L 利福平(Rif)中，在 28℃、240 r/min下振荡培养过夜，取1 mL菌液转移到 30 mL LB培养基(含有50 mg/L Spe+50 mg/L Rif)中，28℃、240 r/min 下振荡培养至OD600约为0.5，于5000 r/min离心6 min，收集沉淀用相同体积液体MS 培养基重新悬浮备用。

1.2.2马铃薯的遗传转化采用农杆菌介导的马铃薯试管薯薄片遗传转化方法[11]。

1.2.3转化再生植株的 PCR检测用 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)法提取转化植株和对照植株的叶片总DNA。参照 Sambrook和Russell[10]的方法对抗性植株进行 PCR 检测。用检测引物G2A1-F(5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCGATCTTCGATTAACGG-3′)和G2A2-R(5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTGGCCTTGCTGGCGATGT-3′)进行 PCR 扩增，预期片段大小为768 bp。用1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 结果。

1.2.4转基因植株实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分别提取DNA检测呈阳性植株的总RNA，用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂进行反转录，具体操作按产品说明书进行。以马铃薯ef1a基因为内参(扩增引物为ef1a-F：5′-CAAGGATGACCCAGCCAAG-3′和ef1a-R：5′-TTCCTTACCTGAA CGCCTGT-3′)，以ARF基因序列设计一对特异性较高的引物ARF-F：5′-GCCTTACCCTTCTTCACTCTCT-3′和ARF-R：5′-CCCATTCCAACATCAGACAC-3′。利用SYBR荧光染料法进行转基因植株的qRT-PCR检测与分析，根据2-△△Ct方法计算出ARF基因的相对表达量[2]。

1.2.5转基因植株试管薯生理指标的测定于2013年7月、8月、9月依次诱导转基因试管薯，并在2013年10月、11月、12月分别收获诱导成功的试管薯3份，贮藏在4℃冰箱中并用于各项生理指标的测定。蔗糖和可溶性糖含量的测定用蒽酮硫酸法[13]。葡萄糖含量的测定用酶比色法[13]。淀粉含量的测定参照张永成和田丰[14]的比重法。可溶性蛋白含量的测定参照李合生[15]的考马斯亮蓝G-250染色法。

试验均重复3次后收集数据，采用Microsoft Excel 2003和SPSS 17.0 专业版软件进行数据处理与分析。

2结果与分析

2.1　马铃薯遗传转化与生根筛选

图1　转基因外植体在Kan选择培养基上芽分化和植株再生　Fig.1　Shoot and plant regeneration from transgenic explants on the selective medium containing kanamycin　　　1：非转基因植株Non-transgenic plant；2：转基因植株 Transgenic plant.

试管薯薄片在分化培养基上培养10 d后即开始膨大并逐渐变绿，20 d后薯片中央有绿色凸起，30 d后凸起处直接分化出绿色芽点，40 d后在薯片凸起处或周边有绿色单芽或丛生芽发出(图1A)，待抗性芽长至2 cm左右时剪下接入附加有50 mg/L Kan和250 mg/L 羧苄青霉素(Carbenicillin，Carb)的MS生根培养基上培养，8 d后植株茎段切口处生根(图1B)，植株能正常生长，对照组外植体基本不能分化出芽，表明再生植株具有Kan抗性，再生植株每20 d在50 mg/L Kan的MS培养基上继代培养1次，继代3次以上均能正常生根及生长的转基因植株为抗性植株，经过Kan 3次筛选共筛选出48株抗性植株。

图2　部分转基因植株的PCR检测Fig.2　Detection of some transgenic plants by PCR　　　M：DL2000 marker； 1：质粒阳性对照 Positive control of plasmid；2：阴性对照，非转基因植株 Negative control， non-transformed plants；3：H2O对照H2O control；4~13：转化植株 Transformed plants.

2.2　转基因植株检测与分析

2.2.1转基因植株的PCR检测用经过Kan筛选获得的48株转化植株的DNA为模板，用引物G2A1和G2A2进行PCR扩增检测，结果有38株扩增出特异性目的片段，与从载体质粒中扩增出片段大小768 bp相符，而非转化植株未扩增出相应条带(图2)，初步证明ARF基因已整合到马铃薯的基因组中。

2.2.2转基因植株的qRT-PCR检测分析以马铃薯ef1a基因为内参，采用qRT-PCR法对马铃薯块茎中ARF基因的表达量进行了检测。结果表明，ARF基因在转基因植株(Z-1～Z-12)中的表达量较对照(G)达到了显著的差异(其中Z-10植株除外)，转基因植株中ARF基因的表达都受到一定程度的干扰。从相对表达量来看Z-11、Z-12的干扰程度比Z-1、Z-7的干扰程度更大，其干扰程度分别高达92.53%和93.22%。而转基因株系Z-10中ARF基因的表达量较对照没有明显差异(图3)。

图3　转基因植株ARF基因表达的qRT-PCR检测结果Fig.3　Result of ARF gene expression in the transgenic plants by qRT-PCR assay　　　G：对照，非转基因植株Control, non-transgenic plant；Z-1~Z-12：7个不同的转基因株系7 different transgenic plant lines.不同字母表示差异显著(P<0.05)The different letters mean significant difference at P<0.05.

2.3　转基因植株生理指标的测定

对转基因植株诱导的试管薯的生理指标的测定结果表明，转ARF基因株系Z-1、Z-2、Z-5、Z-7、Z-11、Z-12的淀粉含量与对照相比，提高了4.29%～34.27%；而蛋白质含量仅有株系Z-2、Z-7、Z-11提高了1.47%~7.35%，其余株系的蛋白质含量均有所下降，可溶性糖含量与对照相比提高了1.44%～17.39%；而转基因植株的蔗糖含量较对照发生了较大的变化，比对照提高了11.53%～53.84%；葡萄糖含量比对照降低了6.06%～21.21%(表1)。

表1　转ARF基因马铃薯试管薯生理指标的测定结果

G：对照，非转基因植株Control, non-transgenic plant；Z-1~Z-12：6个不同的转基因株系6 different transgenic plant lines.邓肯氏新复极差法显著性检测。同列不同小写字母表示0.05差异显著水平，大写字母表示0.01差异显著水平。The assay was performed based on Duncan’s new multiple range test. The lowercases following the datum in each column represent statistically significant difference at the 0.05 level. The capitals following the datum in each column represent statistically significant difference at the 0.01 level.

3讨论

转基因技术是研究基因功能的基本手段，本研究利用根癌农杆菌介导的遗传转化法将ARF基因干扰载体转入马铃薯中，对ARF基因的功能进行探索和研究。已有研究表明，ARF是一类在真核生物进化早期出现的高度保守的GTP激酶，它对于分泌性囊泡的形成是必需的，其在内吞途径、生物合成、类脂的代谢、胚胎发育及物质运输中起重要的调控作用，主要在内质网和高尔基体之间囊泡运输中起作用[16]。Naramoto等[17]研究了依赖于ARF GTPase活性的植物细胞的内同作用调控机制，发现ARF-GEF GNOM 和 ARF-GAP vascular network defective3 (VAN3)参与了植物激素极性运输介导的胚胎发生，并将其定位在质膜及细胞内部结构上。Zuk等[18]证实，抑制马铃薯AFR基因的表达会导致14-3-3蛋白基因的激活，导致植物的表型以及碳水化合物的含量都会发生改变，在获得的转基因马铃薯块茎中出现了亚油酸水平的含量显著增加，同时具有抗氧化能力的酚类物质含量也升高。近几年，随着分子生物学的发展，ARF各种基因和基因产物陆续被发现，以及对其功能的研究也相应展开。

本研究通过经Kan抗性筛选和PCR初步检测得到48株转ARF基因干扰植株。Liu等[19]研究分析表明ARF基因在马铃薯的块茎中优势表达，其中在马铃薯块茎中表达量最高。本研究通过qRT-PCR检测分析ARF基因在转基因马铃薯试管薯中的表达，结果显示转化植株中ARF基因的干扰程度可达到35.23%～93.22%，尤其在株系Z-11和Z-12中，ARF基因表达的干扰程度分别高达92.53%和93.22%。通过测定其试管薯中的淀粉、蛋白质、可溶性糖、蔗糖以及葡萄糖含量，发现转基因株系试管薯的生理指标较对照都有所变化，淀粉含量与对照相比，提高了4.29%～34.27%，其中ARF基因干扰较大的株系Z-11和Z-12的淀粉含量较对照分别提高了25.47%和34.27%，干扰较小的株系Z-2和Z-7的淀粉含量较对照分别提高了4.29%和13.62%，此结果表明ARF基因的干扰表达程度与淀粉含量的增加幅度呈正相关，说明ARF基因在马铃薯淀粉合成途径中起着重要的调节作用。转基因株系蛋白质含量与对照相比，仅有株系Z-2、Z-7、Z-11提高了1.47%~7.35%，其余株系的蛋白质含量均有所下降，说明ARF基因在马铃薯蛋白质合成中没有作为主要的调控因子。转基因植株可溶性糖含量与对照相比提高了1.44%～17.39%，说明ARF基因的抑制表达对可溶性糖的合成具有正向调控作用。转基因植株葡萄糖含量比对照降低了6.06%～21.21%，方差分析其较对照均达到极显著的水平。而转基因植株的蔗糖含量较对照发生了较大的变化，比对照提高了11.53%～53.84%，该结果表明，ARF基因可能作为蔗糖合成过程中的一个负调控因子，对蔗糖的合成具有较大的影响。Zuk等[18]推测ARF基因的抑制表达导致14-3-3蛋白基因的激活，其中14-3-3蛋白基因对硝酸还原酶和蔗糖转化酶的活性有一定的影响，而蔗糖转化酶不可逆的催化蔗糖的水解反应并生成葡萄糖和果糖，是植物体糖代谢途径中重要的酶类之一。马铃薯块茎成熟后碳水化合物的可利用性是维持植株旺盛代谢所必需的[20]。其中淀粉、蔗糖以及葡萄糖作为重要的能量物质，为各器官的生命活动提供养分保障，在不同的生理状态中都具有重要的作用，而ARF基因的干扰表达会在一定程度上使淀粉含量，蔗糖有所增加，葡萄糖含量降低。ARF基因在马铃薯试管薯形成过程中具体的生理功能还有待进一步深入研究。

4结论

采用农杆菌介导法，获得了ADP核糖基化因子(ARF)干扰基因的转基因马铃薯植株。用qRT-PCR检测表明，转化植株中ARF基因表达的干扰程度可高达93.22%。RNA干扰基因的导入导致转基因植株试管薯的淀粉、可溶性糖、蛋白质、蔗糖和葡萄糖含量发生了一定程度的变化。研究结果为进一步研究ARF基因在马铃薯块茎中的作用奠定了一定的基础。

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Genetic transformation using an RNAi vector containing anARFgene in potato and effects on physiological characteristics of microtuber

PEI Ruifang1,2, LIU Ying1,2, LIU Bailin1, ZHANG Ning2, SI Huaijun1,2*, WANG Di1*

1.GansuKeyLaboratoryofCropGeneticandGermplasmEnhancement,GansuProvincialKeyLaboratoryofAridlandCropScience,Lanzhou730070,China; 2.CollegeofLifeScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China

Abstract:Using potato (Solanum tuberosum) cultivar ‘Gannongshu 2’ as donor, 48 transgenic plants were obtained through an Agrobacterium-mediated transformation method using an RNAi vector containing an ADP-ribosylation factors (ARF) gene. Testing of the transformed plants on a culture media containing kanmycin and PCR assay showed that the AFR gene had been successfully integrated into the potato genome. The analysis of real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) data showed that the ARF gene expression declined to varying degrees in the transgenic plants compared with the controls, and interference degree reached 92.53% and 93.22% in the transgenic lines Z-11 and Z-12, respectively. The starch content of the transgenic plants increased by 4.29%-34.27%, the protein content by 1.47%-7.35%, the soluble sugar content by 1.44%-17.39%, and the sucrose content by 11.53%-53.84% compared with control plants; however, the glucose content of the transgenic plants decreased by 6.06%-21.21% compared with control plants.

Key words:potato; ARF gene; interference vector; transgenic plants; physiological characteristics

*通讯作者

Corresponding author. E-mail:hjsi@gsau.edu.cn，wangd@gsau.edu.cn

作者简介：裴瑞芳(1990-)，女，甘肃天水人，在读硕士。E-mail:peirfsmile@163.com

基金项目：甘肃省杰出青年基金项目(1308RJDA011)和国家自然科学基金项目(31160298)资助。

*收稿日期：2014-02-25；改回日期：2014-03-25

DOI：10.11686/cyxb20150216

http://cyxb.lzu.edu.cn

裴瑞芳， 刘英， 刘柏林， 张宁， 司怀军， 王蒂. 马铃薯ARF基因RNAi载体的遗传转化及对其试管薯生理特性的影响. 草业学报， 2015， 24(2)： 142-147.

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