体外培养SD大鼠神经干细胞多向分化的实验研究*

黄学平 郑捍东 叶维霞 吴文友

(泸州市人民医院 1.神经外科, 2.消化内科， 四川 泸州 646000)

体外培养SD大鼠神经干细胞多向分化的实验研究*

黄学平1郑捍东1叶维霞2吴文友1

(泸州市人民医院 1.神经外科, 2.消化内科， 四川 泸州 646000)

目的 分离培养SD大鼠神经干细胞( NSCs)，诱导分化，为神经干细胞的分化研究提供基础实验依据。方法 分离新生24小时内SD大鼠端脑及中脑，采用无血清培养技术进行NSCs体外扩增培养及传代。对NSCs及其分化后的细胞进行nestin、GFAP、NF 200免疫细胞化学染色。结果 分离培养的细胞增殖活性好，6～7天后生长成由上百个细胞组成的大克隆球，nestin呈阳性表达。经诱导分化后，克隆球间存在网络状结构，GFAP和NF 200呈阳性表达。结论 实验中分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力，并具有向星形胶质细胞和神经元等方向分化的多向分化潜能。

SD大鼠； 神经干细胞； 免疫细胞化学； 多向分化

神经干细胞是存在于神经系统内的一群具有多向分化潜能和自我更新能力的细胞，可以分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞[1，2]。近年来，神经干细胞的研究成为神经科学领域的热点之一。神经干细胞移植被认为是治疗神经系统损伤后修复和其他神经系统疾病最具前景的方案之一[3]。本研究采用新生24小时内清洁级SD大鼠作为供体，分离培养神经干细胞，通过观察、检测神经干细胞向神经元、星形胶质细胞分化的生物学特性，为神经干细胞的分化研究提供更多实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 新生24小时内清洁2级SD大鼠，购于南方医科大学动物实验中心。

1.2 主要试剂 DMEM/F12培养基，D-Hank’s液(Hyclone)，B27神经细胞生长添加剂(Gibco)，bFGF、EGF(Peproteeh)，多聚赖氨酸(Sigma)，胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司。nestin抗体购自Chemicon公司，NF 200和GFAP抗体购自武汉博士德生物技术有限公司。台盼蓝、免疫组化SP试剂盒和DAB显色试剂盒由北京中杉生物技术有限公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1 NSCs的原代分离培养 NSCs的分离：取新生24小时内清洁级SD大鼠4只，用75%乙醇消毒头部后，断头处死，在超净台内以眼科剪逐层剪开头皮及颅骨后，无菌条件下迅速取出端脑及中脑放入预冷的D-Hank’s 液中，去除脑膜及血管后剪碎，加入0.125%胰酶、0.02% EDTA液4 ml，37℃消化20～30 min后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基4 ml终止消化，轻柔吹打至混悬液后，用400目筛网过滤，收集滤液，1000 rpm离心5 min，弃去上清，用D-Hank's重复清洗3遍后，加入完全培养基(含2% B27，20 μg/L bFGF，20 μg/L EGF的DMEM/F12培养基)重悬细胞悬液，台盼蓝染色计数后，调整细胞密度为1×106/ml接种于培养瓶中，置37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。接种后的细胞每2～3 d半量换液，培养6～7 d传代1次。逐渐去除碎片及其他细胞，分离出NSCs。

1.3.2 NSCs的传代培养 在原代培养第7天，无菌条件下进行传代培养。轻轻摇动培养瓶，用吸管将沉在瓶底而没有贴壁的神经球收集入离心管，弃去贴壁的细胞，1500 rpm离心5min，吸去上清液后，加入NSCs完全培养基，轻柔吹打使神经球尽可能分离为单细胞悬液，计数后仍以1×106/ml接种于培养瓶中常规培养。此后每2～3 d半量换液，培养6～7 d传代1次。

1.3.3 NSCs的免疫化学鉴定 取生长良好的第3代NSCs克隆球，1×105/ml接种至预先放置多聚赖氨酸包被的无菌盖玻片的24孔板内，继续培养8小时，使大部分克隆球贴壁，将盖玻片取出自然晾干。PBS清洗2次，每次5 min，用4%多聚甲醛固定30 min后， PBS清洗干净后以3% H2O2去离子水孵育10 min，清洗3次，再以山羊血清封闭液37℃封闭10 min。滴加一抗nestin(1∶100)，37℃孵育2小时，PBS清洗3次，每次5 min，滴加二抗B液37℃孵育20 min，PBS清洗3次，再滴加C液37℃孵育15 min，具体步骤参照SP试剂盒说明书。PBS清洗3次后DAB显色，苏木素复染，封片。对照染色以PBS代替一抗，余相同。

1.3.4 NSCs的诱导多向分化 取含生长良好的第3代NSCs克隆球的细胞悬液，1500 rpm离心5 min，弃去上清，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12 (1∶1)培养液轻柔吹打为单细胞悬液后，接种于多聚赖氨酸包被的无菌盖玻片的24孔板内，随时观察NSCs分化状态，继续培养7天后，进行GFAP和NF 200的免疫细胞化学染色，方法步骤同nestin。

2 结果

2.1 NSCs形态学观察及免疫细胞化学鉴定 倒置显微镜下动态观察原代培养NSCs，细胞悬液接种24小时后可见大量单个大小相近的圆形细胞，细胞核大，胞质较少，折光性较高；2～3 d半定量换液后可见较多悬浮生长的形态不一的细胞球，呈桑椹状，每个细胞球由数个到数十个细胞组成，折光性强，无突起生长；6～7 d后，生长成由上百个细胞组成的大克隆球(图1a)。神经细胞克隆球经免疫细胞化学染色后，神经干细胞特异性表达的巢蛋白nestin呈强阳性表达，胞浆呈棕黄色(图1b)。

图1 NSCs克隆球形态及nestin免疫细胞化学染色

Figure 1 The morphology and nestin immunocytochemistry of neurosphere

注：a.培养6天的神经干细胞球，呈桑椹状(×400)；b. 神经干细胞球nestin呈强阳性表达(SP,×200)

2.2 NSCs的诱导分化 将培养第3代的NSCs克隆球用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行诱导分化，12小时后可见到部分NSCs克隆球紧贴细胞培养瓶，许多伪足样突起从克隆球中伸出；分化至第3 天时，可见许多单个细胞逐渐从克隆球中迁出，细胞由圆形转变为有突起的细胞(图2)。培养至第7天时，细胞突起明显增多，细胞之间形成广泛的网络状结构。

2.3 NSCs诱导多向分化细胞的免疫细胞化学鉴定 将NSCs培养至第7天时，细胞呈现多种形态，采用不同神经细胞特异性抗体进行免疫细胞化学鉴定。结果显示，星形胶质细胞标记抗体GFAP在多角形胞体分化细胞的胞浆中呈阳性表达(图3a)。此类细胞从胞体伸出许多长的突起，连成网状。神经元标记抗体NF 200在卵圆形胞体分化细胞的胞浆中呈阳性表达(图3b)。该类细胞发出突起相对较少，大部分细胞发出2个细胞突起。

图2 神经干细胞球诱导分化后3天(×400)

Figure 2 Neurosphere differentiation for 3 d (×400)

3 讨论

近年来，NSCs已被研究证实广泛分布于胚胎和成年哺乳动物中枢神经系统的若干区域。胚胎脑的端脑、海马、纹状体、中脑、室管膜/室管膜下区、脊髓和成年脑的脑室下区、纹状体、海马颗粒下区等已成功分离培养出NSCs[2]。NSCs因其具有自我维持、自我更新、可迁徙性、转分化性、低免疫原性、多向分化潜能等生理特性，使其成为基因治疗的载体或供体细胞，且可在Ⅳ型胶原的诱导下分化为平滑肌细胞参与神经组织血管再生，为临床上脊髓损伤、帕金森病、周围神经损伤后肌肉萎缩的治疗等提供了新的思路和方法[4～7]。

图3 NSCs诱导分化细胞的GFAP和NF200免疫细胞化学染色

Figure 3 GFAP and NF200 immunocytochemistry of differentiated cells derived from NSCs

注：a. 分化细胞GFAP阳性 (SP,×400)；b. 分化细胞NF200阳性 (SP,×400)

本研究从新生24小时内清洁级SD大鼠的端脑及中脑成功地分离培养了NSCs，NSCs在含有能刺激神经干细胞增殖的生长因子B27、bFGF 和EGF无血清培养液中大量增殖，呈悬浮球形生长，并连续传代生长，体现NSCs自我维持和自我更新的特性。巢蛋白(nestin)是中间丝蛋白家族的成员，被列为第Ⅵ类中间丝蛋白，该蛋白主要在神经系统中的神经干细胞及神经前体细胞中表达，可以作为神经干细胞和神经前体细胞以及胰岛前体细胞的特异性标志物[8]。巢蛋白的表达是暂时性的，一旦前体细胞分化成终末分化细胞如神经元或胶质细胞，巢蛋白的表达便终止[9,10]。我们的实验结果可见，经过传代培养的神经细胞克隆球nestin呈强阳性表达，表明了经传代培养的神经细胞克隆球保持了神经干细胞特性。当去除神经干细胞增殖的生长因子的作用，NSCs置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养3天后，NSCs发生分化，不仅表现为细胞生长方式发生改变，由悬浮生长变为贴壁生长，而且细胞形态也发生了改变，由圆形分化为卵圆形、多角形等多种形态的有突起细胞。随着细胞的继续分化，细胞突起明显增多，分化细胞之间形成广泛的网络状结构。成熟星形胶质细胞和神经元分别表达其特异性标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元标记抗体NF 200。我们采用免疫细胞化学显示，GFAP和NF200在分化细胞中呈阳性表达，表明神经干细胞经过诱导分化后，部分细胞分化为神经胶质细胞和神经元，体现了NSCs的多向分化潜能。

4 结论

通过从新生SD大鼠的脑组织成功分离、培养出NSCs，并且向星形胶质细胞和神经元等方向分化，体现了NSCs自我维持、自我更新和多向分化的基本特征。神经干细胞的体外培养为后续神经干细胞的分化研究提供了更多的实验依据，对细胞移植治疗中枢神经系统疾病的研究具有重要意义。

[1]McKay R.Stem cells in the central nervous system[J].Science,1997,276(5309):66-71.

[2]Irene A,FiIippo C. Rdial glia and neuraI stem cells[J]. Cell Tissue Res,2008,331(1):165-178.

[3]Lendahl U, Zimmerman LB，Mckay RD.CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein[J]. Cell, 1990,60(23):585-595.

[4]王岗，彭丽媛，巩守平，等. MHP36神经干细胞体外经Ⅳ型胶原诱导向平滑肌细胞分化的研究[J].西部医学,2012,24(6):1045-1049.

[5]孟红旗，全亚萍.神经干细胞在神经系统疾病中的应用[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(1):175-178.

[6]Gage FH. Mammalian neural stem cell[J].Science,2000,287(5457):1433-1438.

[7]陈嘉利，周继辉，郎金波.神经干细胞在脊髓损伤中的应用与进展[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(14):2631-2634.

[8]Parati EA, Bez A, Ponti D,etal. Neural stem cells. Biological features and therapeutic potential in Parkinson's disease[J]. J Neurosurg Sci, 2003,47(1):8-17.

[9]丁继固,丁文杰，李光.胶质源性神经营养因子与白细胞介素1β体外诱导中脑神经干细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(27):5033-5036.

[10] 史东梅，周畅，谢佐平.神经干细胞有丝分裂过程中nestin表达变化 [J].神经解剖杂志,2003,19(2):119-123.

The study on multiple differentiation of neural stem cells isolated from SD rat in vitro

HUANG Xueping1, ZHENG Handong1,YE Weixia2,etal

(1.DepartmentofNeurosurgery,LuzhouPeople'sHospital,Luzhou646000,Sichuan,China; 2.DepartmentofGastroenterology,LuzhouPeople'sHospital,Luzhou646000,Sichuan,China)

Objective To cultivate and induce differentiation of the neural stem cells(NSCs)in vitro, thus providing the experimental evidence for further related research．Methods Tissues of telencephalon and midbrain were isolated from the neonatal SD rat，then the NSCs were cultivated in serum-free culture medium．The immunocytochemistry was applied to detect the expression of nestin, GFAP and NF200 on NSCs and differentiated cells．Results The isolated cells grew well and grew into sphere clones of hundreds of cells after six or seven days, with positive expression of nestin. There were network-like structure between sphere clones, which expressed GFAP and NF200 protein by inducement. Conclusion The isolated and cultivated NSCs have the capacities of self-renew and proliferation, as well as pluripotentiality of differentiate into neurons and astrocytes.

SD rat; Neural stem cell; Immunocytochemistry; Multi-directional differentiation

泸州市科技计划项目(2012-S-40)

郑捍东，主任医师，E-mail:704421424@qq.com

R 446.7

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.06.004

2014-07-10； 编辑： 张文秀)