回神颗粒对大鼠局灶性脑缺血再灌注脑损伤的保护机制研究*

回神颗粒对大鼠局灶性脑缺血再灌注脑损伤的保护机制研究*

摘要：目的：观察回神颗粒对缺血性卒中脑海马区不同时间点S100B蛋白表达的动态变化,研究回神颗粒对局灶性脑缺血再灌注损伤影响的可能机制。方法:取45只Wistar大鼠建立局灶性脑缺血再灌注(I/R)模型,随机分成假手术对照组、脑I/R组、回神颗粒治疗组,缺血2h后开始再灌注。免疫组化法检测缺血不同时间各组脑海马缺血中心和周围区S100B蛋白,原位末端标记技术检测各组脑海马缺血中心和周围区神经细胞凋亡。结果：脑I/R损伤组与假手术对照组比较，细胞凋亡数明显增多(P<0.05), 回神颗粒治疗组与脑I/R组相比,凋亡细胞数明显减少(P<0.05);免疫组化检测结果显示, I/R组与假手术对照组相比, S100B蛋白表达明显增加(P<0.05), 回神颗粒治疗组与脑I/R组相比, S100B蛋白表达明显减少(P<0.05)。结论：回神颗粒可能通过减少S100B蛋白表达、抗凋亡对局灶性脑缺血再灌注损伤(I/R)产生保护作用。

关键词：回神颗粒；脑缺血；再灌注脑损伤；神经细胞；凋亡

前期临床研究发现，回神颗粒在治疗创伤性脑损伤、脑梗塞[1]、脑出血[2]、各种痴呆[3]等神经疾病方面都取得了良好的疗效。实验研究发现,回神颗粒对脑缺血再灌注损伤(I/R)具有神经保护作用[4]。S100B蛋白是神经胶质细胞分泌的蛋白质,是反映神经细胞损伤的标记物,目前国内外尚无给予回神颗粒治疗脑缺血灌注区S100B蛋白动态观察的相关报道。为进一步探讨回神颗粒对缺血性脑损伤产生保护作用的机制,本文观察了大鼠局灶性脑缺血再灌注后给予回神颗粒灌胃后对大鼠海马区S100B蛋白表达的影响。

1材料与方法

1.1材料选用体重200～250g健康雄性Wistar大鼠45只，清洁级，合格证编号DK0501-0018，购自河北省实验动物中心，在天津中医药大学动物实验中心适应性饲养1周，隔日更换一次饲料及饮水。10%水合氯醛(沈阳试剂厂)，SABC试剂盒，原位细胞凋亡检测试剂盒TUNEL(POD)(天津市灏洋生物制品科技责任有限公司提供)，DAB显色剂(武汉博士德); 回神颗粒(天津中医药大学附属武清中医医院);抗S100B抗体，尼龙线直径2.3mm(日本伊东公司);BT-100恒流泵(上海沪西分析仪器厂)；全自动冰冻切片机(德国徕卡CM1850)；OLYMPUS HB-2显微镜(日本)，计算机图像分析软件(美国600CL Pixera)。

1.2实验方法

1.2.1动物模型制备及分组缺血模型大鼠参照Zea-Longa线拴法复制大脑中动脉缺血模型(MCAO)。大鼠用10%水合氯醛(0.9mL/250g)麻醉，暴露出左侧颈总动脉和分叉部，分离动脉分叉处的颈内动脉和颈外动脉，并分别穿线备用。将颈外动脉近心端结扎，将预先准备好的直径为0.235mm、长约5cm、前端加热成圆形的渔线栓子，用肝素浸泡后从剪口处插入，使渔线栓子经颈总动脉分叉部进入颈内动脉，向头端深入至有阻力时，即阻断大脑中动脉(MCA)入口处，结扎颈总动脉及剪口处，清洁缝合伤口。假手术对照组除不插入栓子外其余同实验组。手术中和手术后维持动物体温在37℃左右。缺血2h后,拔出栓子2mm,使血液再灌注。45只大鼠随机分成I/R模型组、治疗组、假手术组，各组再分成1d、3d、7d 3个亚组，每个亚组5只，分别于缺血后1d、3d、7d取脑组织。

1.2.2缺血各组处理方法均于术后当日起给药。回神颗粒组给予回神颗粒灌胃。具体做法：用生理盐水将回神颗粒稀释成混悬液，按每人每日三次剂量5g×3=15g，则大鼠(体重200～250g)每日剂量为0.018g×15=0.27g，配成3mL灌胃液，每日一次性灌服治疗，连续治疗7d；假手术组和脑缺血模型(I/R)组仅给予3mL0.9%生理盐水灌服。

1.2.3组织处理按不同缺血时间断头,取脑组织。实验分3组:假手术组、 I/R组及回神颗粒治疗组,每组15只,均为脑缺血2h再灌注1d、3d、7 d处死,每个时间点5只。

1.2.4免疫组化染色检查各组大鼠至指定时间点处死后断头取脑,取前囟前后1mm脑组织,常规固定,石蜡包埋,每隔100μm连续冠状切片(厚6μm),进行免疫组化染色检测S100B蛋白的表达情况。显微镜下观察海马细胞胞浆有棕褐色颗粒者为阳性细胞。

1.2.5TUNEL原位凋亡染色法检测细胞凋亡按照原位TUNEL试剂盒说明书对各组大鼠脑组织切片进行凋亡染色,细胞核中出现棕褐色颗粒者为阳性细胞。

2结果

2.1各组S100B蛋白表达脑I/R损伤组与假手术对照组相比, S100B蛋白表达明显增加(P<0.01), 回神颗粒治疗组较脑I/R组S100B蛋白表达明显减少(P<0.05),见表1。

表1不同脑I/R时间点各组大鼠海马

组别1d3d7dI/R模型组27.4±1.14*26.2±2.387*17.8±1.789*治疗组22.4±1.949*#13.4±1.517*#11.2±1.581*#假手术组7.3±1.0926.9±1.1376.1±0.998

注：与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05。

2.2神经细胞凋亡情况脑I/R组与假手术对照组比较，神经细胞凋亡数明显增多(P<0.01), 回神颗粒治疗组与脑I/R组比较，神经细胞凋亡数明显减少(P<0.05),见表2。

　　　个

注：与模型组比较，*P<0.01，与假手术组比较，※P<0.05。

3讨论

回神颗粒由全国名中医专家、博士生导师、享受国务院特殊津贴专家,全国第三批名老中医经验继承指导老师,首届中医药传承特别贡献奖获得者,中华中医药学会老年病分会副主任委员陈宝贵教授经过近50年的临床及实验研究研制而成,应用于临床,对高血压性脑出血急性期、创伤性颅脑损伤等疗效显著,可有效降低致残率,提高生存质量[5]。

回神颗粒主要以鹿角、丹参、菖蒲、灵芝、郁金等药物组成,该药补益五脏精气,兼以化郁、祛痰、消瘀,从而调整五脏功能,达到治疗目的。现代药理研究发现[6]，人参皂苷可以减少钙沉积;石菖蒲水提醇沉液可以改善脑缺血缺氧状态，促进学习记忆能力，抑制大鼠神经细胞凋亡[9];丹参酮具有钙通道拮抗作用，减轻钙超载;丹参、五味子、川芎嗪均可以对抗氧自由基引起的损伤[7]。该药的前期动物实验表明：回神颗粒可减少脑挫伤面积、细胞损伤、脑水肿程度，甚至还能恢复认知功能，改善空间记忆。作用机制目前有几种理论：庞莹等[4]认为，回神颗粒是通过上调BDNF的表达，起到控制脑缺血面积以及神经保护和修复的作用。赵廷浩等[8]发现，回神颗粒能改变Bcl/Bax基因表达的比率,使BclmRNA水平升高,BaxmRNA水平降低,产生抗细胞凋亡的作用。

本实验显示,对脑缺血再灌注损伤的大鼠使用回神颗粒治疗后，可以明显减少凋亡细胞数和S100B蛋白表达,说明回神颗粒能明显减少I/R造成的神经细胞凋亡,提示局灶性脑缺血时给予回神颗粒治疗，对神经元的保护作用可能与减少凋亡细胞的产生、S100B蛋白表达有关。这可能是回神颗粒治疗各种脑损伤疾病、对脑缺血产生保护作用的机制之一。

参考文献

[1]陈宝贵,赵振发,卞景芝,等.回神颗粒对实验性大鼠局灶性脑缺血缺血区神经细胞凋亡的影响[J].天津中医药,2006,23(3)：227-230.

[2]陈慧娲,刘海东,陈宝贵.回神颗粒治疗急性高血压脑出血的疗效观察[J].天津中医药,2005,22(4)：330-330.

[3]崔俊波,陈慧娲,李洪艳,等.回神颗粒治疗血管性痴呆临床疗效观察[J].时珍国医国药,2007,18(9)：2 166-2 167.

[4]庞莹,陈宝贵,杨卓.回神颗粒对大鼠急性脑梗死损伤中BDNF表达的影响[J].吉林中医药,2010,30(6)：535-537.

[5]刘海东,李传勇,陈慧娲,等.回神颗粒治疗重型颅脑创伤临床疗效观察[A].《中医脑病杂志》编辑部.中华中医药学会老年神经病专题学术研讨会论文专辑[C].天津：《中医脑病杂志》编辑部，2006：105-107.

[6]何艳芳，郭学芬，王军.参麦对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的干预作用[J].现代中西医结合杂志，2014，23(5)：475-479.

[7]邹琼，严明敏，查运红，等.五味子乙素保护神经细胞作用及其可能机制[J].医药导报，2013，32(8)：1 010-1 012.

[8]赵廷浩,卞景芝,陈慧娲,等.回神颗粒对大鼠坐骨神经损伤后神经与骨骼肌组织形态学的影响[J].天津中医药,2006,23(4)：320-323.

[9]方永奇，吴启瑞.石菖蒲对于缺血再灌注脑损伤大鼠神经细胞凋亡的影响[J].现代中西医结合杂志，2002,11(17):1 647-1 649.

(收稿日期：2014-05-27)编辑：万崇毅

*基金项目：国家中医药管理局全国名老中医传承工作室建设项目(国中医药人教发[2011]41号)。

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

作者简介：★刘丹*刘丹(1981—)，女，博士。研究方向：心血管疾病。Tel：15122588780，E-mail：niki19860717@163.com。指导：陈宝贵(天津中医药大学附属武清中医医院天津 301700)