胃癌患者细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5蛋白的检测意义

胃癌患者细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5蛋白的检测意义

曾静, 张俊

(湖北医药学院附属十堰市太和医院 体检中心, 湖北 十堰, 442000)

关键词:胃癌; 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5; 检测

胃癌是消化道的一种常见恶性肿瘤，对人类的健康构成了严重的威胁[1]。1992年细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶 5(Cdk5)被鉴定，定位于染色体7号长臂第3区第6带(7q36)上，其能在全身不同组织细胞内分布[2]。本研究通过免疫组化染色等方法探讨胃癌中Cdk5蛋白的表达及意义，现报告如下。

1资料与方法

1.1　一般资料

分析2010年5月—2014年5月在本院接受手术治疗的胃癌患者的胃癌组织和癌旁正常组织标本(包埋于石蜡中)。病例需全部接受病理的确诊。术前病例均无任何放化疗史，对所有患者实施D2胃癌根治术。随访全组患者，随访时间为3～76个月。由经验丰富的2位病理医师复查所有入选对象的HE切片，确保病理诊断的准确性。

1.2　研究方法

免疫染色二步法: ① 将包埋于石蜡中胃癌组织切片(4 μm)后烘干; ② 使用梯度松节油和酒精对切片进行脱蜡，然后用蒸馏水和PBS液水化切片; ③ 对切片实施高压法达到将抗原修复的目的; ④ 孵育后PBS液冲洗; ⑤ 滴加一抗，即兔抗人Cdk5多克隆1∶500); ⑥ 滴加试剂MT-CelLytics，滴加试剂RIPA(细胞裂解液); ⑦ 使用DAB溶液进行显色反应; ⑧ 采用苏木素对切片进行复染; ⑨ 将切片脱水后使用中性树胶进行封片处理; ⑩ 构建空白对照，用PBS液代替步骤⑤中的一抗，其他均相同。

一抗用PBS代替作阴性对照，组织呈阳性作阳性对照。随机从每片中抽取高倍视野(×400) 5个，计算细胞阳性率。判断染色结果：参照肿瘤着色强度和细胞阳性率记分。着色强度：≥4分，高表达; 1～3分，低表达; 0分，无表达。细胞阳性率: >51%, 3分; 26%～50%，2分; 6%～25%，1分；≤5%，0分。

提取胃癌组织蛋白: ① 在匀浆器内将胃癌组织与MT-CelLytics、Mammalian Protease Inhibitor Cocktail匀浆; ② 离心匀浆液; ③ 提取上清液存于冰箱内备用。

蛋白定量(BAC法): ① 配制蛋白标准液; ② 配制BAC工作液; ③ 在96孔板中加适量标准品于标准品孔内，样品孔内加入体积样品; ④ 将BAC工作液加入各孔内; ⑤ 通过测量波长、A562以及标准曲线计算蛋白浓度。

免疫印迹法(检测Cdk5蛋白在新鲜胃癌组织中的表达量): ① 变性蛋白样品与缓冲液的混合液后制胶; ② 在泳道内滴加预染蛋白marker及样品; ③ 电泳后电转膜; ④ 使用硝酸纤维素膜进行染色反应; ⑤ 将免疫反应非特异性的结合位点封闭后加一抗，孵育; ⑥ 回收一抗后滴加二抗; ⑦ 取ECL发光试剂适量进行发光反应; ⑧ 扫描、曝光; ⑨ 和密度半定量分析。比较胃癌组织与癌旁组织、原发灶与转移灶的Cdk5表达差异，并探讨Cdk5表达与胃癌组织的病理特征间的相关性。

1.3　统计学方法

数据均采用SPSS 19.0软件进行分析。数据计量以均数±标准差表示，比较采用卡方(χ2)检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1　一般资料

本研究共纳入胃癌患者103例，包括胃癌组织及癌旁组织标本各103个。入组的患者临床资料见表1。

表1　患者临床资料

2.2　胃癌与癌旁组织、原发灶与转移灶的Cdk5表达比较

胃癌与癌旁组织、原发灶与淋巴结转移灶的Cdk5阳性表达强弱见表2, 可见胃癌组织的Cdk5强阳性表达率显著低于癌旁组织(χ2=18.26,P<0.01)。

表2　胃癌与癌旁组织、原发灶与转移灶的Cdk5表达比较

2.3　Cdk5表达与胃癌组织的病理特征相关性

不同病理特征包括组织学分型、肿瘤直径、肿瘤部位、Borrmann分型及淋巴结转移情况的胃癌组织所对应的Cdk5表达情况见表3，结果提示胃癌组织的Cdk5的阳性表达与胃癌组织的组织学分型(χ2=11.59,P<0.01)、Borrmann分型(χ2=10.53,P<0.01)和淋巴结转移情况(χ2=14.62,P<0.01)均有显著相关性。

表3　Cdk5表达与胃癌组织的病理特征相关性

3讨论

目前中国胃癌的死亡率在逐年上升，对中国人的健康构成了严重的威胁，给家庭和社会都造成了沉重的负担，是常见的一种恶性肿瘤[3]。Cdk5是周期依赖性蛋白酶一族中的特殊成员，其不直接对细胞周期(哺乳动物)进行调控，细胞周期蛋白也不能将Cdk5激活[4]。Cdk5可以在大脑发育期间调控神经细胞的死亡和生存信号、迁移、轴突和分化的延伸、激活和形成突触以及骨架成分等，参与多种疾病的发病过程，跟各种肿瘤的形成都有着密切的关系[5]。

本研究实施免疫组化染色SP法，结果显示在胃癌组织内，Cdk5表达的弱阳性、强阳性率与癌旁组织相比较，二者的差异有统计学意义。将患者病理学参数和Cdk5的表达程度结合分析发现，Cdk5的表达程度和胃癌的Borrmann分型、淋巴结是否发生转移以及组织学分型的关系都很密切，因此作者可以推测Cdk5蛋白与胃癌的发生可能有关联，呈现出的低表达率也许对胃癌的发病过程起着一定的促进作用[6]。此外，本研究还发现Cdk5 蛋白在淋巴结转移癌组织内的阳性率比原发胃癌组织中明显低，差异有统计学意义[7]。将患者病理学参数和Cdk5的表达程度结合分析发现，Cdk5的表达程度和淋巴结转移量以

及肿瘤浸润深度密切相关，肿瘤浸润深度随着Cdk5表达的降低而加深，淋巴结转移量随着Cdk5表达的降低而增加，故作者推测Cdk5对抑制蛋白的转移起着一定的作用，胃癌病程中，癌细胞使自身Cdk5蛋白的水平下降，从而达到促进浸润转移的目的[8]。

还有研究[9]指出Cdk5表达是对胃癌患者预后评估的一个独立因素，患者的5年存活率是随着Cdk5在癌组织内表达的上升而上升。在胃癌的诊疗方面，Cdk5蛋白有望成为靶点。总之，本研究结果显示，相对癌旁组织，Cdk5在胃癌组织内为明显低表达；而相对原发的胃癌组织，Cdk5在淋巴结转移癌中为明显低表达；同时发现Cdk5的表达与肿瘤的组织学分型、淋巴结是否发生转移及Borrmann分型密切相关[10]。

参考文献

[1]Ma Y, Zhang L, Rong S, et al. Relation between gastric cancer and protein oxidation, DNA damage, and lipid peroxidation[J]. Oxid Med Cell Longev, 2013, 2013: 543760.

[2]Wu X L, Cheng B, Li P Y, et al. MicroRNA-143 suppresses gastric cancer cell growth and induces apoptosis by targeting COX-2[J]. World J Gastroenterol, 2013, 19(43): 7758.

[3]Zhang J, Zhan Z, Wu J, et al. Relationship between EGF, TGFA, and EGFR Gene Polymorphisms and Traditional Chinese Medicine ZHENG in Gastric Cancer[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2013, 2013: 731071.

[4]颜伟, 张永红, 何乐亚, 等. 胃癌中CDK1和CDK2的表达及预后意义[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志, 2010, (02): 165.

[5]Wang Y Q, Zhang S J, Lu H, et al. A C 21 -Steroidal Glycoside Isolated from the Roots of Cynanchum auriculatum Induces Cell Cycle Arrest and Apoptosis in Human Gastric Cancer SGC-7901 Cells[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2013, 2013: 180839.

[6]Zhang B, Hao GY, Gao F, et al. Lack of association of common polymorphisms in MUC1 gene with H. pylori infection and non-cardia gastric cancer risk in a Chinese population[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2013, 14(12): 7355.

[7]Tuncel T, Karagoz B, Haholu A, et al. Immunoregulatory function of HLA-G in gastric cancer[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2013, 14(12): 7681.

[8]谢妮. 环氧化酶2、细胞周期调节蛋白依耐性激酶CDK2在胃癌中的表达[J]. 南华大学学报:医学版, 2009, (06): 703.

[9]Yang L, Sun M J, Liu J W, et al. IL-6-6331 (T/C, rs10499563) is associated with decreased risk of gastric cancer in Northern Chinese[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2013, 14(12): 7467.

[10]王妍, 周建奖, 谢渊, 等. 钙调蛋白、钙网蛋白及周期蛋白依赖性激酶1基因在胃癌组织中的表达[J]. 肿瘤防治研究, 2013, (2): 151.

基金项目:湖北省十堰市科技局科研项目(EK2013D150001000079)

收稿日期:2014-12-20

中图分类号:R 735.2

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)09-153-02

DOI:10.7619/jcmp.201509051