SIRT2在胃癌组织中的表达与临床预后的关系

张　舟, 杨庭松, 陈　希, 王　群, 张　逖, 房　林

(同济大学附属第十人民医院 普外科, 上海, 200072)

SIRT2在胃癌组织中的表达与临床预后的关系

张舟, 杨庭松, 陈希, 王群, 张逖, 房林

(同济大学附属第十人民医院 普外科, 上海, 200072)

摘要:目的探讨胃癌组织中SIRT2的表达及其与临床病理特征及预后的相关性，并初步研究SIRT2在胃癌细胞中的作用。方法采用Western-blot法检测胃癌组织和癌旁正常胃黏膜组织中SIRT2蛋白表达的差异；用免疫组织化学法，检测100例胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织中SIRT2的表达情况，分析其表达水平与临床病理特征及预后的关系；将SIRT2-siRNA质粒转染胃癌细胞，通过Transwell实验观察下调SIRT2表达对胃癌细胞迁移侵袭能力的影响。结果SIRT2在胃癌组织和癌旁正常胃黏膜组织中阳性表达率分别为67%(67/100)、16%(24/100), 差异有统计学意义(P<0.01)；胃癌组织中SIRT2的高表达与胃癌的淋巴结转移、临床分期及患者预后显著相关；体外细胞实验显示下调SIRT2表达可抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。结论SIRT2可作为判断胃癌患者预后的一个独立指标，并有潜力成为一个胃癌靶向治疗的新靶点。

关键词:胃癌; SIRT2; 预后

近年来，在欧美等发达国家，胃癌的发病率和死亡率均有所下降，但胃癌仍然是世界上最常见的恶性肿瘤之一[1-2]。表观遗传学理论的不断完善和分子生物技术的迅猛发展，为研究胃癌的发生发展机制以及探索新的治疗靶点提供了新契机。沉默信息调节因子2(Sir2)相关酶类(Sirtuins)是最近发现的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖的第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶类[3]，可通过对组蛋白、转录因子等蛋白质的赖氨酸残基进行去乙酰化修饰作用来调控靶基因的转录和表达[4], 从而参与了机体代谢、细胞分化、凋亡以及肿瘤的发生发展等病理生理过程[5]。人类Sirtuins家族中公认的成员有7个，即SIRT1～SIRT7[6]。本研究采用Western-blot法检测胃癌组织和癌旁正常胃黏膜组织中SIRT2蛋白表达的差异，通过免疫组化法检测SIRT2表达水平并探讨其与临床病理特征及预后的关系，并采用RNA干扰技术下调SIRT2的表达以初步探索其在胃癌细胞中的作用。

1资料与方法

1.1　一般资料

选择同济大学附属第十人民医院普通外科2004年1月—2008年12月行胃癌根治术并具有完整随访资料的胃癌患者100例。其中男72例，女28例；年龄41～82岁，平均(58.67±7.29)岁。所有患者既往无其他肿瘤罹患病史；术前均未行放化疗等辅助治疗；术后标本经病理组织学检查证实为胃癌。所有临床组织标本的采集均经同济大学伦理委员会批准，患者及(或)其家属知情同意。

1.2　方法

1.2.1Western blot检测胃癌组织和癌旁正常胃黏膜组织中SIRT2蛋白的表达：随机选取3对胃癌组织和癌旁正常胃黏膜组织，置研磨器加裂解液中研磨至匀浆，置低温高速离心机(FL-20, Beckman)中以12 000 r/min, 离心30 min, 取上清，常规行BCA法蛋白定量。10% SDS-PAGE电泳分离, 4 ℃转PVDF膜(Sigma公司，美国)2 h, 5% BSA室温封闭1 h, 加入SIRT2单克隆抗体(Santa Cruz公司，美国)4 ℃孵育过夜，洗膜5 min, 加入HRP标记的二抗(Santa Cruz公司，美国) 37 ℃孵育1 h, 0.05% TBST洗膜5 min, 加入化学发光试剂(上海博华生物公司)显色曝光，凝胶成像仪(美国杜邦公司)显示图像，扫描图片，BandScan 5.0软件分析条带灰度值。

1.2.2免疫组化染色：胃癌及正常胃黏膜组织标本均经10%甲醛固定，脱水机处理后石蜡包埋, 5 μm切片，采用免疫组化SP法，具体操作步骤按试剂盒说明书进行, DAB显色及苏木素复染。所有标本均设阳性对照并用PBS缓冲液代替一抗做阴性对照。SIRT2单克隆抗体和β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司, DAB显色试剂盒及免疫组化SP试剂盒购自上海博华生物公司。

1.2.3细胞培养、传代及转染：胃癌BGC-823细胞株由上海生物化学与细胞生物学研究所提供，常规37 ℃、5% CO2条件下培养与传代。取处于对数生长期的BGC-823细胞，弃去培养液，调整细胞浓度至1×105/mL接种6孔板，置入37 ℃、5% CO2培养孵育箱中培养，待细胞密度达到60%～80%, 按LipfectamineTM2000脂质体试剂盒说明书将SIRT2-siRNA质粒(Santa Cruz公司，美国)转染胃癌细胞，并设置阴性对照组。

1.2.4Transwell细胞迁移、侵袭实验：收集细胞，待测细胞培养至对数生长期，用无血清培养基悬浮细胞，计数并调整浓度为1×105/mL，在Transwell Chamber(BD Biosciences公司，美国)(孔径=8 μm)下室加入600～800 μL含10% FBS的培养基，上室加入100～150 μL细胞悬液，继续在孵箱培养24 h, 用镊子小心取出Chamber, 吸干上室液体，移到预先加入约800 μL甲醇的孔中，室温固定30 min, 取出Chamber，吸干上室固定液，移到预先加入约800 μL Giemsa染液(上海江莱生物科技公司)的孔中，室温染色15～30 min; 清水冲洗浸泡数次，取出Chamber，吸去上室液体，用湿棉棒擦去上室底部膜表面上的细胞，揭下膜，底面朝上晾干，移至载玻片上用中性树胶封片。显微镜下取5个随机视野计数，统计结果。细胞侵袭实验即将Matrigel基质胶(BD Biosciences公司，美国)在4 ℃过夜融化，用4 ℃预冷的无血清培养基稀释Matrigel基质胶至终浓度1 mg/mL, 冰上操作，在Chamber上室底部中央垂直加入100 μL稀释后的Matrigel, 37 ℃温育4～5 h使其干成胶状，后续步骤同迁移实验。

1.3　评价标准

免疫组化结果判定：以细胞质内有棕黄色颗粒者为染色阳性。观察切片中5个高倍视野，肿瘤细胞染色阳性率>25%为阳性，≤25%为阴性。阳性细胞按着色强度和范围分级：标本阳性细胞呈淡黄色或阳性细胞率为25%～50%为弱阳性, 50%～75%为中度阳性，>75%为强阳性。

2结果

2.1　SIRT2在胃癌组织和癌旁正常胃黏膜组织中的表达差异

胃癌组织中SIRT2蛋白表达水平显著高于癌旁正常胃黏膜组织，差异有统计学意义(P<0.05), 见图1。

注:NC为癌旁正常胃黏膜组织,GC为胃癌组织,*P<0.05图1 胃癌组织和癌旁胃正常黏膜组织中SIRT2蛋白的表达

2.2　胃癌组织中SIRT2的阳性表达及其与临床病理特征的关系

SIRT2阳性染色定位于细胞浆内，阳性显色为不均质棕色颗粒。胃癌组织和癌旁正常胃黏膜组织中SIRT2的阳性表达率分别为67%(67/100)、16%(24/100), 差异具有统计学意义(χ2=37.28,P<0.01)。T0～T1期患者中SIRT2高表达者占61.4%, T2～T3期占78.5%; Ⅰ～Ⅱ期患者中SIRT2高表达者占46.2%, Ⅲ～Ⅳ期占67.7%, SIRT2的高表达与胃癌的淋巴结转移(P=0.004)及临床分期(P=0.01)显著相关。

2.3　胃癌组织中SIRT2的阳性表达与临床预后的关系

将SIRT2弱阳性和阴性表达者定义为低表达组，将SIRT2中度阳性及强阳性定义为高表达组。统计结果显示胃癌患者SIRT2高表达组59例，中位生存时间1.6年；而低表达组41例，中位生存时间2.2年，差异有统计学意义(P=0.02)。

2.4　下调SIRT2表达对胃癌细胞的迁移和侵袭能力的影响

下调SIRT2表达后的胃癌细胞迁移及侵袭能力显著减弱(P<0.05或P<0.01), 见图2。

图2细胞迁移和侵袭实验

3讨论

Sirtuins与恶性肿瘤的发生发展密切相关。Cha等[7]研究发现胃癌组织中SIRT1基因的表达与肿瘤分期、淋巴及转移、组织类型、p53表达具有相关性，并且其表达水平与总体生存率和无复发生存率呈负相关。Chen等[8]研究发现SIRT1在肝细胞癌组织中高表达，并且其表达与肿瘤的分期呈正相关，而沉默SIRT1基因则可抑制TERT和PTOP基因的表达水平，从而诱导细胞的衰老和凋亡。Zhao等[9]研究发现SIRT1在胰腺癌组织中高表达，并且其表达水平与肿瘤患者的年龄、肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移等临床病理特征具有显著相关性，而沉默和下调SIRT1基因的表达可通过增加FOXO3a的表达来诱导胰腺癌细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

SIRT2亦参与了某些恶性肿瘤的进展过程，可通过去乙酰化修饰肿瘤相关基因调控其表达及生物活性等分子机制来影响肿瘤细胞的生物学功能，并且在不同组织来源的肿瘤中其功能亦不尽相同，可表现为肿瘤发展的促进子或抑制子[10]。Li[11]等研究表明，沉默下调宫颈癌Hela细胞SIRT2的表达水平可降解p38 MAPK激活依赖的p300和MDM2蛋白，引起p53的聚集增多，进而诱导Hela细胞的凋亡。Zuo等[12]研究发现沉默下调胆囊癌细胞中SIRT2基因的表达可通过去乙酰化修饰和调节肌动蛋白的表达，从而抑制胆囊癌细胞的迁移和侵袭。Hiratsuka等[13]发现SIRT2在人神经胶质瘤细胞中低表达，并且可通过对微管网络的调节而抑制肿瘤细胞的增殖。Kim等[14]发现SIRT2缺陷雄性小鼠形成了多种消化道肿瘤包括胰腺癌、结肠癌和胃癌等，并且SIRT2可通过促使共激活子APCCDH1和CDC20去乙酰化，参与细胞分裂重要组件—分裂后期促进复合体(APC/C)的活性调控，引起细胞在分裂过程中发生异常染色体分离导致基因组失稳从而发挥其生物学功能。

本研究中，SIRT2在胃癌组织中显著高表达，其表达水平与胃癌的淋巴结转移、临床分期、预后密切相关，体外细胞实验揭示下调SIRT2表达可抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力，因此，胃癌组织中SIRT2可能参与了胃癌的侵袭和转移过程，而抑制其表达可遏制胃癌的进展。

综上所述，SIRT2可作为判断胃癌患者预后的一个独立指标，且有潜力成为一个胃癌靶向治疗的新靶点。

参考文献

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Correlation between SIRT2 expression in gastric

carcinoma tissues and clinical prognosis in

gastric cancer patients

ZHANG Zhou, YANG Tingsong, CHEN Xi, WANG Qun, ZHANG Ti, FANG Lin

(DepartmentofGeneralSurgery,TenthPeople′sHospitalofTongjiUniversity,Shanghai, 200072)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the expression of SIRT2 and the relationship with clinicopathological characteristics and prognosis in patients with gastric cancer, and to investigate the role of SIRT2 in gastric carcinoma cells preliminarily. MethodsThe expressions of SIRT2 in gastric carcinoma tissues and adjacent normal gastric mucosa tissues were detected using Western-blot method. Immunohistochemistry was performed in gastric carcinoma and adjacent normal gastric mucosa tissues from 100 gastric cancer patients to determine the expressions of SIRT2 and the relationships with clinicopathological characteristics and prognosis were analyzed. Then gastric carcinoma cells were transfected with SIRT2-siRNA and the inhibition effect of SIRT2 downregulation on migration and invasion of these cells were observed through transwell experiment. ResultsThe expression rate of SITR2 in gastric carcinoma tissues and adjacent normal gastric mucosa tissues were 67%(67/100) and 16%(24/100) respectively and the difference was significant (P<0.01). High expression of SIRT2 in gastric carcinoma tissue was obviously related with lymph node metastasis, clinical stage and prognosis. Downregulation of SIRT2 expression suppressed the ability of migration and invasion of gastric carcinoma cells. Conclusion SIRT2 can be an independent marker of prognosis in patients with gastric cancer and be a potential target for Gastric Cancer targeted therapy.

KEYWORDS:gastric carcinoma; SIRT2;prognosis

通信作者:房林, E-mail: fanglin_f@126.com

基金项目:中国高校医学期刊临床专项资金(11521781)

收稿日期:2015-01-09

中图分类号:R 735.2

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)09-069-04

DOI:10.7619/jcmp.201509020