糯玉米自交系中游离氨基酸的组成及含量分析

孟 强，王薪淇，宋轶群，赵仁贵

(吉林农业大学 农学院，吉林 长春 130118)

糯玉米自交系中游离氨基酸的组成及含量分析

孟 强，王薪淇，宋轶群，赵仁贵

(吉林农业大学 农学院，吉林 长春 130118)

【目的】 研究糯玉米自交系中游离氨基酸的组成及含量，对糯玉米种质资源的营养品质进行评价。【方法】 采用邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定了60份糯玉米自交系籽粒的游离氨基酸组成及含量，并采用主成分分析法进行综合评价。【结果】 从60份糯玉米自交系中共检测出16种氨基酸，最少的检测出14种氨基酸，其中JN57的氨基酸总量最高(25.165 mg/g)，JN21的氨基酸总量最低(6.403 mg/g)，平均为12.236 mg/g，含量高于平均值的有25份。人体必需氨基酸(EAA)含量在2.47～13.97 mg/g，占游离氨基酸总量的 29.43%～75.52%。对60份糯玉米自交系所含的16种氨基酸进行主成分分析及综合评价，得分值在前3位的依次为JN57、JN59和JN55。【结论】 60份糯玉米自交系的游离氨基酸含量具有明显的遗传多样性，其中JN57、JN59及JN55的品质较优，JN21的品质最差。

糯玉米；自交系；游离氨基酸；HPLC；种质资源

由于糯玉米鲜食口感好而且营养丰富，随着社会经济的发展和人们生活水平的提高，鲜食糯玉米的需求量迅速增长，在我国已发展成为一项新兴产业[1]。中国是糯玉米的起源地，地方种质资源丰富[2]，大量研究表明，鲜食糯玉米具有良好的营养和保健价值，使其作为主食谷物的可行性增强[3]，进而掀起了糯玉米育种的热潮。糯玉米种质资源是糯玉米新品种选育的物质基础，在育种工作中占有举足轻重的地位。

游离氨基酸(FAA) 中包含多种人类不能合成的必需氨基酸和呈味氨基酸，是评价食品营养品质的重要指标之一[4]。玉米籽粒中氨基酸的含量和组成，也是决定其营养品质和食味品质优劣的重要指标[5]。王敏等[6]测定了玉米浆中游离氨基酸的含量，证明能够用HPLC法来测定玉米中游离氨基酸含量；郝小琴等[7]测定了鲜食甜糯玉米籽粒的氨基酸含量，为糯玉米的品质育种提供了参考。但关于糯玉米自交系中游离氨基酸含量的研究报道目前尚不多见。

我国虽然已育成了一批鲜食糯玉米新品种，但是审定的糯玉米品种大多数只是达到了审定要求，而品质优良者不多，通过对国家区域试验总结报告的分析可以看出，提高糯玉米食用品质是我国当前鲜食糯玉米育种的主要任务[8]。因此，不断挖掘糯玉米种质资源，正确评价与利用糯玉米自交系，培育优良糯玉米新品种，是当前玉米育种亟待解决的问题。本试验采用邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，检测了60份糯玉米自交系中游离氨基酸的组成及含量，通过分析评价糯玉米自交系的营养品质和食味品质，筛选出具有优良品质的糯玉米自交系，以为培育品质优良的糯玉米新品种提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材 料 试验材料为吉林农业大学特用玉米育种课题组选育的60份糯玉米自交系。选取自然风干、灌浆良好且无病虫害的玉米自交系果穗中部籽粒20粒，置40 ℃烘箱中烘干24 h，将其用谷物籽粒粉碎机粉碎成粉末，混匀过孔径0.28 mm标准筛后装入密封袋备用[9]。

1.1.2 试 剂 乙醇、冰乙酸、氢氧化钠、磷酸二氢钠、四硼酸钠、邻苯二甲醛(OPA)、巯基乙醇等，均为国产分析纯；乙腈和甲醇(美国Sigma)为色谱纯；超纯水由Milli-Q超纯水系统制备(美国Millipore)。

1.2 仪器与设备

Dionex U3000 HPLC高效液相色谱系统(配DGP-3600泵、WPS-3000 自动进样器、TCC-3100自动控温柱箱、DAD-3000检测器和变色龙色谱工作站)、AUW220电子天平(日本岛津)、HWS-26 电热恒温水浴锅(上海)、KQ-100DE 型数控超声波清洗器(江苏昆山)、Sigma3-30k 高速冷冻离心机(美国Sigma)。

1.3 方 法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm，i.d.)；柱温：40 ℃；检测波长：338 nm；流速：1 mL/min。流动相A：V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=45∶45∶10；流动相B：10 mmol/L、pH7.5的磷酸二氢钠。洗脱程序：0 min，100%B；10 min，82%B；15 min，76%B；21 min，59%B；23 min，57.8%B；25 min，42%B；27 min，41%B；31 min，100%B。

1.3.2 在线衍生化 用自动进样针吸取5.0 μL pH 9.5的硼酸缓冲液，再吸取1.0 μL的OPA，洗针1次，再吸取2.0 μL样品，洗针1次，原位混合8次，等待90 s进样。

1.3.3 样品处理 准确称取0.3 g样品，用一定体积比的溶剂(纯水)研磨后装入试管中，分别于室温超声振荡30 min，离心(12 000 r/min，10 min)后滤渣重新超声提取1次。合并2次上清液，0.22 μm尼龙微孔滤膜过滤后保存于-20 ℃冰箱中，用于HPLC分析。

1.3.4 定性与定量分析 根据16种氨基酸标准品的保留时间，对样品中的氨基酸种类进行定性；根据各氨基酸标准品对样品中的氨基酸进行定量分析，以氨基酸标准品质量浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标，求得 16 种氨基酸的线性方程，采用面积归一化法计算测试样品的游离氨基酸含量。

1.3.5 分析软件和指标计算公式 利用SPSS 20分析软件对试验数据进行主成分分析。

I=a1y1+a2y2+…+amym。

式中：I为样品的综合评价指数，am为主成分Ym的方差贡献率，ym为各样品的各主成分分值。

2 结果与分析

2.1 游离氨基酸标准色谱图及其回归分析

在选定的色谱条件下，以一系列不同质量浓度的16 种混合氨基酸标准溶液依次进样，得到游离氨基酸标准品色谱图(图1)，以峰面积y对相应的质量浓度x(μg/mL)做标准曲线，得到16种氨基酸的线性方程(表1)，并以此作为定量依据。表1结果表明，各方程在所检测的质量浓度范围内均呈良好的线性关系，其相关系数均大于0.998 9。

2.2 糯玉米自交系游离氨基酸的组成及变异度

不同糯玉米自交系中游离氨基酸经OPA在线衍生化，HPLC分离检测，得出色谱峰图(图2)。定性分析结果显示：不同糯玉米自交系中共检测出16种游离氨基酸，包括7种必需氨基酸，9种非必需氨基酸。游离氨基酸含量检测结果(表2)显示：60份糯玉米自交系中最少的检测出14种氨基酸；JN57的氨基酸总量最高，为25.165 mg/g；JN21的氨基酸总量最低，为6.403 mg/g；平均为12.236 mg/g，含量高于平均值的有25份。在供试样品的游离氨基酸组成中，Asp、Glu、Ser和Tyr含量较高，这4种氨基酸总量在3.193～19.591 mg/g ，占游离氨基酸总量的30.98%～79.72%。Thr的含量极低，在大部分样品中未检测出。

各游离氨基酸在不同糯玉米自交系中含量变幅大，为0.000～8.727 mg/g(表3)，其中Thr、Ala变异度较大，变异系数大于100%；Arg、Cys、Val、Asp、Tyr、Ser、Met、Lys居中，变异系数在50%～100%；Glu、Gly、His、Leu、Phe、Ile的变异度较小，变异系数小于50%。不同来源的糯玉米自交系中，游离氨基酸的种类和含量存在显著差异。

2.3 糯玉米自交系游离氨基酸的含量分析

人体(或其他脊椎动物)不能合成或合成速度远不适应机体的需要，必须由食物蛋白供给的氨基酸称为必需氨基酸(EAA)，包括Ile、Leu、Lys、Thr、Val、Phe、Met。糯玉米自交系中人体必需氨基酸含量在2.47～13.97 mg/g，占游离氨基酸总量的 29.43%～75.52%，平均含量5.85 mg/g(表2)。不同糯玉米自交系中各必需氨基酸的含量不同，Ile和Met含量最高的是JN59，Leu含量最高的是JN55，Lys、Thr、Val和Phe含量最高的均是JN58。人体虽然能够合成His和Arg，但通常不能满足正常的需要，因此，又被称为半必需氨基酸或条件必需氨基酸，在幼儿生长期这2种是必需氨基酸。糯玉米自交系中儿童必需氨基酸含量为0～2.09 mg/g，占游离氨基酸总量的0～13.91%，平均含量0.98 mg/g。His含量最高的是JN36，Arg含量最高的是JN16。人(或其他脊椎动物)自己能由简单的前体合成，不需要从食物中获得的氨基酸称为非必需氨基酸。糯玉米自交系中非必需氨基酸含量在2.83～14.27 mg/g。

注：(1)▲必需氨基酸，△非必需氨基酸，★儿童必需氨基酸，■鲜味氨基酸，◆甜味氨基酸，●芳香族氨基酸；(2)-.未检测到；(3)TAA.氨基酸总量；(4)呈味氨基酸(DAA)=■+◆+●；(5)E/T.必需氨基酸总量占氨基酸总量的百分比，CE/T.儿童氨基酸总量占氨基酸总量的百分比，DAA/T.呈味氨基酸总量占氨基酸总量的百分比。

Note:(1)▲Essential amino acids (E)，△Non-essential amino acids(N)，★Children essential amino acids(CE)，■Flavor amino acids，◆Sweet amino acids，●Aromatic amino acids；(2)-.Not detected；(3)TAA.Total amino acids；(4)Delicious amino acids ( DAA )=■+◆+●；(5)E/T.Ratio of total essential amino acids，CE/T.Ratio of total children essential amino acids，DAA/T.Ratio of total delicious amino acids.

食物中因富含一些呈味氨基酸，食用时极易扩散，可与口腔内多种味觉受体作用，故能让人感到食物的美味。鲜味氨基酸包括Glu和Asp，甜味氨基酸包括Ala、Gly、Ser，芳香族氨基酸包括Tyr和Phe。鲜食糯玉米的口感非常重要，其含有的呈味氨基酸起到重要作用。由表2可以看出：糯玉米自交系中鲜味氨基酸含量为0.875～9.607 mg/g，占游离氨基酸总量的5.97%～47.36%，平均含量 3.25 mg/g；甜味氨基酸含量为0.724～4.228 mg/g，占游离氨基酸总量的4.85%～30.72%，平均含量1.85 mg/g；芳香族氨基酸含量为0.772～9.377 mg/g，占游离氨基酸总量的8.49%～48.16%，平均含量3.23 mg/g。

2.4 主成分分析及综合评价

选取检测到的糯玉米自交系16种游离氨基酸的含量数据，利用SPSS 20分析软件进行主成分分析，结果表明，16个主成分代表了全部原始信息的100%，其中第1主成分(PC1 51.649%)、第2主成分(PC2 20.177%)、第3主成分(PC3 12.386%)包含了全部原始信息的84.212%，通常认为可以代表大部分原始信息[10]，因此提取前3个主成分。第1主成分主要包括8个指标：PC1=0.465 Gly+0.608 Ala+0.994 Tyr+0.765 Met+0.492 Phe+0.596 Ile+0.470 Leu+0.609 Lys；第2主成分主要包括2个指标：PC2=0.759 Asp+0.866 Glu；第3主成分主要包括1个指标：PC3=0.876 Ser。采用主成分分析进行综合评价时，可以选取m个主成分，即Y1，Y2，…，Ym，以每个主成分的方差贡献率作为权重，构造综合评价指数，计算出每个样品品质的综合评价指数后，按照指数的大小排序，可以得出每个样品的综合品质名次，通常综合指数越大，综合品质就越好[11]。孙立军等[12]通过这种方法对苹果的品质做了综合评判。本研究根据抽取的3个主成分，计算了不同糯玉米自交系的综合评价指数，结果见表4。由表4可以看出，综合评价指数大于1的自交系有3个，分别是JN57、JN59和JN55，表明这3个糯玉米自交系游离氨基酸的综合评价最好。JN21的综合评价指数最小，说明其游离氨基酸的主成分含量偏低。

3 讨 论

随着人们生活水平的不断提高，鲜食糯玉米的选育越来越关注营养品质和食味品质，而品种选育的基础是种质资源。柯永培等[13]研究发现，玉米氨基酸性状的遗传呈现以下规律：异亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)和甘氨酸(Gly)含量主要受加性基因效应影响，赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)和天冬氨酸(Asp)含量受加性效应和非加性效应同等影响，其余10种氨基酸含量主要受非加性效应影响；广义遗传力较高的有苯丙氨酸(Phe)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和丙氨酸(Ala)，而狭义遗传力相对较高的为缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、精氨酸(Arg)和甘氨酸(Gly)，丝氨酸(Ser)的狭义遗传力最低。本研究检测了60份糯玉米自交系游离氨基酸的组成及其含量，结果表明Asp、Glu、Ser和Tyr含量显著，各游离氨基酸在不同糯玉米自交系中含量变幅大，其中Thr、Ala变异度较大，变异系数大于100%；Glu、Gly、His、Leu、Phe、Ile的变异度较小，变异系数小于50%。不同来源的糯玉米自交系中，游离氨基酸的种类和含量存在显著差异，必需氨基酸含量在2.47～13.97 mg/g，占游离氨基酸总量的29.43%～75.52%；鲜味氨基酸含量为 0.875～9.607 mg/g，占游离氨基酸总量的 5.97%～47.36%；甜味氨基酸含量为0.724～4.228 mg/g，占游离氨基酸总量的4.85%～30.72%；芳香族氨基酸含量为0.772～9.377 mg/g，占游离氨基酸总量的8.49%～48.16%。根据前人研究的游离氨基酸遗传规律，育种者可以有目的地选择某种游离氨基酸含量高的自交系作为亲本，培育出某种氨基酸含量高的新品种。祁新等[14]研究也发现，如果要提高玉米籽粒的赖氨酸含量，双亲的赖氨酸含量都要高；要提高蛋氨酸含量，亲本自交系的蛋氨酸含量差异不宜过大，最好都是高含量的；只要亲本选配得当，就能提高玉米籽粒中的某种或几种氨基酸的含量。

对60份糯玉米自交系中的16种游离氨基酸含量进行主成分分析和综合评价，结果表明JN57、JN59、JN55的得分较高，而这3个自交系中各种游离氨基酸含量及总量均较高，与综合评分结果相符，表明这3个自交系的综合营养品质和食味品质较优。JN21样品的综合评分最低，也与其游离氨基酸含量最低相符合，说明该自交系的氨基酸品质不佳。目前在鲜食糯玉米育种过程中，通常是将组配出的杂交组合种植后进行果穗品尝鉴定，在自交系阶段的鉴定较少，同时人工品尝鉴定除了食品本身品质的因素外，还与品尝人的喜好有关，人为误差较大[15]，这导致糯玉米品种的遗传改良方向性不强。通过对自交系呈味氨基酸的测定和分析，在一定程度上对自交系的食味品质进行了评价，再与人工品尝鉴定结果相结合，能够显著提高糯玉米品质育种的工作效率。

4 结 论

1)在糯玉米自交系中共检测出16种游离氨基酸，其中7种为必需氨基酸，9种为非必需氨基酸，最少的检测出14种氨基酸，有10种氨基酸的变异系数大于50%。各自交系游离氨基酸总含量的变异幅度为6.403～25.165 mg/g，具有明显的遗传多样性。

2)糯玉米自交系中呈味氨基酸含量丰富，其中，鲜味氨基酸含量占游离氨基酸总量的5.97%～47.36%，甜味氨基酸含量占游离氨基酸总量的4.85%～30.72%，芳香族氨基酸含量占游离氨基酸总量的8.49%～48.16%。说明各自交系的营养品质和食味品质存在较大差异。

3)利用主成分分析法对60份自交系进行综合评价，构造出综合评价指数，高于平均得分的共有23份自交系，其余自交系与平均值相接近，其中JN57、JN59、JN55自交系得分突出。

4)综合糯玉米自交系中的游离氨基酸总含量、必需氨基酸含量、呈味氨基酸含量以及主成分综合评价指数得分进行评价，JN57、JN59和JN55的品质较优，JN21的品质最差。

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Composition and content analysis of free amino acids in waxy maize inbred lines

MENG Qiang,WANG Xin-qi,SONG Yi-qun,ZHAO Ren-gui

(CollegeofAgriculture,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

【Objective】 This study aimed to analyze the components and contents of free amino acids in waxy maize inbred lines and evaluate the nutritional quality of germplasm resources.【Method】 An effective reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) after pre-column derivatization with o-phthaladehyde (OPA) was used to determine the components and contents of free amino acids in 60 waxy maize inbred lines and principal component analysis was conducted for comprehensive evaluation.【Result】 A total of 16 (with the minimum of 14) free amino acids were detected from the 60 inbred lines.JN57 had the highest total content of 25.165 mg/g while JN21 had the lowest of 6.403 mg/g.The average content was 12.236 mg/g and 25 samples exceeded the average.The contents of essential amino acids (EAA) varied from 2.47 to 13.97 mg/g,accounting for 29.43%-75.52% of total free amino acids.Principal component analysis showed that first three inbred lines with the highest scores were JN57,JN59,and JN55.【Conclusion】 The contents of free amino acids in 60 waxy maize inbred lines showed clear genetic diversity.JN57,JN59 and JN55 had the best quality while JN21 had the worst.

waxy maize;inbred line;free amino acids;HPLC;germplasm resources

2013-11-12

吉林省财政厅项目“优质多抗特用玉米杂交种的选育”(2012002)；长春市科技局项目“特用玉米新品种选育及高产栽培技术研究”(2011215)

孟 强(1988-)，男，山东邹城人，在读硕士，主要从事作物重要性状遗传规律研究。E-mail：zcmengq@163.com

赵仁贵(1966-)，男，吉林前郭人，教授，博士，博士生导师，主要从事特用玉米遗传规律和新品种选育研究。 E-mail：zhaorengui@sina.com

时间:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.004

S513.3

A

1671-9387(2015)03-0091-07

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.004.html