不同消毒剂对甘肃红豆草种子消毒效果及萌发的影响

董文科，马晖玲，陈春艳

(甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

不同消毒剂对甘肃红豆草种子消毒效果及萌发的影响

董文科，马晖玲，陈春艳

(甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

利用正交设计试验研究了3个不同种子预浸泡时间(6，12和24 h)，3种消毒剂(10% H2O2，30% NaClO和0.1% HgCl2)和3个不同消毒时间(10，20和30 min)对甘肃红豆草种子萌发率、污染率及发芽指数的影响，以获取甘肃红豆草无菌苗时种子的最佳消毒方法。结果表明，3个因素对发芽率影响差异显著；预浸泡时间对发芽指数影响差异极显著，而对污染率影响差异不显著；消毒剂种类及消毒时间对污染率和发芽指数影响差异显著。综合各项因素，室温条件下无菌水预浸泡24 h、0.1% HgCl2消毒20 min种子发芽率较高，污染率较低，发芽较快且出苗整齐，是获取甘肃红豆草无菌苗种子的最佳消毒方式。

消毒剂；红豆草；萌发；污染

在植物细胞工程试验中，以无菌种苗作为外植体，获得愈伤组织和再生植株，进一步进行转基因操作；为了获得高质量的RNA，常选择幼嫩的无菌苗为RNA提取的试验材料[1]。

甘肃红豆草(Onobrychisviciaefoliacv.Gansu)属多年生豆科牧草，是由甘肃农业大学等单位选育出的对甘肃生境有较强适应性的品种[2]。其茎叶茂盛，草质柔嫩，含有丰富的维生素和矿物质，适口性好，各类家畜均喜食[3]，是优质牧草之一[4]。在植物基因工程研究中，红豆草又作为优良基因的重要来源[5]。所以，红豆草种子的消毒及无菌苗的培养在植物细胞工程试验中发挥着十分重要的作用。通过研究不同的消毒剂对甘肃红豆草种子消毒效果及种子萌发等的影响，为甘肃红豆草无菌种苗的培养、高效再生体系的建立和优良基因的转化提供有益参考。

1 材料和方法

1.1 供试材料

甘肃红豆草，由甘肃农业大学草业学院提供。

MS培养基所用的无机盐、蔗糖以及琼脂为国产分析纯，各种维生素和激素购自上海生工生物有限公司，试验用水均为蒸馏水。

1.2 试验方法

将甘肃红豆草饱满种子，室温下，用无菌水预浸泡不同时间后，75%的乙醇浸泡30 s，不同消毒剂浸泡处理，按3因素3水平正交试验，正交表选用L9(34)[6](表1)，然后用无菌水反复冲洗5～6次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，接种于MS培养基上，每瓶15粒，6 次重复，25 ℃、光照14 h/d(光照强度2000 lx)的恒温箱下萌发。试验期间，观察记录红豆草种子发芽与污染情况，发芽数逐日统计，第7 d以后萌发率已基本不变，计算发芽率及发芽指数。

表1 正交试验L9(34)表头设计Table1 Orthogonal design

1.3 数据分析

种子发芽率=正常发芽的种子粒数/供试种子总粒数×100%

污染率=染菌株数/总株数×100%

发芽指数(Gi)=ΣGt/Dt

式中：Gt为在时间t日的发芽数，Dt为发芽日数。

以SPSS 19统计学软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 各因素对甘肃红豆草种子发芽率影响分析

不同因素水平极差(R)的大小，说明该因素对试验结果的影响程度。各因素对甘肃红豆草发芽率影响的直观分析结果表明，不同因素对甘肃红豆草发芽率影响的主次关系为消毒时间>消毒剂种类>预浸泡时间(表2)。结合方差分析，3个因素对甘肃红豆草发芽率均有显著意义(P<0.05)，且影响大小为，消毒时间>消毒剂种类>预浸泡时间，与直观分析结果一致(表3，4)。对3个因素采用LSD多重比较(表3)，结果表明，不同预浸泡时间对发芽率影响差异显著，发芽率由高到低为24，12和6 h。消毒剂种类对发芽率影响差异显著，发芽率由高到低为0.1% HgCl2，30% NaClO和10% H2O2。消毒时间对发芽率影响差异显著，发芽率由高到低为20 min，10 min和30 min。试验分析可得，获得最高发芽率的最优消毒方案为预浸泡24 h、0.1% HgCl2消毒20 min，红豆草种子发芽率为67.78%。

2.2 各因素对甘肃红豆草种子污染率影响分析

各因素对污染率直观分析(表3)表明，对甘肃红豆草污染率影响的极差大小为RB>RC>RA，不同因素对甘肃红豆草污染率影响的主次关系为消毒剂种类>消毒时间>预浸泡时间。结合方差分析(表4)，消毒剂的种类对污染率的差异极显著(P<0.01)，消毒时间对污染率的差异具有显著影响(P<0.05)，而预浸泡时间对污染率影响差异不显著(P>0.05)，3个因素影响大小为消毒剂种类>消毒时间>预浸泡时间，与直观分析结果一致。对3个因素采用LSD多重比较(表3)，结果表明0.1% HgCl2，30% NaClO和10% H2O2之间对污染率影响差异极显著；消毒20 min和30 min与消毒10 min之间差异显著，而消毒20 min和30 min差异不显著。各项分析比较可得，获得最低污染率的最优消毒方案为：0.1% HgCl2消毒20 min或30 min，但消毒30 min会使发芽率降低，因此，采用0.1% HgCl2消毒20 min。

表2 正交试验L9(34)试验结果Table2 Result of orthogonal experiment

表3 正交设计直观分析和多重比较Table3 Result of direct analysis and multiple comparison

注：L表示每个水平相同因子的估算边际平均值，R表示每个因子估算边际平均值的极差；不同大、小写字母分别表示0.01水平显著(F≥F0.01)和0.05水平显著(F≥F0.05)

2.3 各因素对甘肃红豆草种子发芽指数影响分析

各因素对发芽指数直观分析(表3)表明，对甘肃红豆草发芽指数影响的极差大小为：RA>RB>RC，不同因素对甘肃红豆草发芽指数影响的主次关系预浸泡时间>消毒剂种类>消毒时间。结合方差分析(表4)，预浸泡时间对发芽指数的影响差异极显著(P<0.01)，消毒剂的种类和消毒时间对发芽指数影响差异显著(P<0.05)，3个因素影响大小为预浸泡时间>消毒剂种类>消毒时间，与直观分析结果一致。对3个因素采用LSD多重比较(表3)，结果表明，预浸泡24 h与预浸泡6 h和12 h之间对发芽指数影响差异显著；10% H2O2和30% NaClO与 0.1% HgCl2之间对发芽指数影响差异显著，而10% H2O2和30% NaClO差异不显著，但从降低污染率考虑，30% NaClO消毒效果优于10% H2O2，因此，常选用30% NaClO；消毒20，30 和10 min之间差异显著，而消毒20 min和30 min差异不显著，但从降低污染率考虑，消毒30 min效果优于20 min。因此，获得较高发芽指数的最优消毒方案为：预浸泡24 h、30% NaClO消毒30 min。

表4 正交试验方差分析Table4 Result of variance analysis

注：**表示0.01水平显著(F≥F0.01)，*表示0.05水平显著(F≥F0.05)

3 讨论和结论

试验中种子消毒，选择合适的消毒剂和消毒时间是获得无菌苗的关键因素。判断某种消毒方法是否合适，要综合考虑发芽率、污染率、发芽势等因素[7-10]。试验中得出，3个指标最优方案分别为预浸泡24 h、0.1% HgCl2消毒20 min发芽率最高；预浸泡24 h、0.1% HgCl2消毒20 min污染率最低；预浸泡24 h、30% NaClO消毒30 min发芽指数最高。但30% NaClO消毒30 min污染率高达18.89%，而且消毒时间太长会使种子由褐色变为黄色，对种子造成一定损伤[11]。综合考虑种子萌发情况和污染情况，试验最佳消毒方案为无菌水预浸泡24 h、0.1% HgCl2消毒20 min。

研究表明，HgCl2作为消毒剂其消毒效果最好[12]，然而HgCl2可以使蛋白质变性，其对植物的毒性较大。经过HgCl2处理的种子，其发芽率、发芽势均不高，但这种消毒方法处理操作相对简便，抑菌效果稳定，所以被广泛作为较大体积种子的消毒剂[13]。对于红豆草这种体积较大，并且种皮上附着大量内生真菌的种子[14]，HgCl2消毒是最佳的选择。

有资料报道，油菜(Brassicanapus)、月季(Rosahvbrida)、生姜(Zingiberofficinale)的外植体除了采用常规的消毒方法外，还有使用抗生素、抗菌素等抑菌药剂处理外植体，具有一定的抑菌效果[15-17]。至于其他消毒剂对甘肃红豆草种子的消毒效果和影响，仍有待于进一步研究。

[1] 张玉,李聪,白史且,等.三种不同消毒剂对饲草菊苣种子萌发和生长的影响[J].草业学报,2010(1):253-257.

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[4] 周万海,师尚礼,周娟娟.NaCl胁迫对甘肃红豆草生理特征的影响[J].草原与草坪,2012,32(3)：32-35.

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Effects of different disinfectants on seed sterilization and germination ofOnobrychisviciaefoliacv.Gansu

DONG Wen-ke,MA Hui-ling,CHEN Chun-yan

(CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem，MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

Experiments with orthogonal design were carried out to explore an optimal sterilizing method forOnobrychisviciaefoliaseeds through pre-soaking (6,12,24 h) and different disinfectants (10% H2O2,30% NaClO,0.1% HgCl2) and sterilizing time (10,20,30 min),The germination,contamination rate and germination index of were measured.The results showed that all factors had the significant effects on germination;the pre-soaking time had the most significant effects on germination,but it was not significant on contamination .The disinfectants and sterilizing time had significant effects on contamination and germination .Therefore,the best treatment was pre-soaking in sterilized distilled water for 24 h at room temperature,and then to treat the seed with 0.1% (w/v) aqueous mercuric chloride for 20 min .

disinfectants;Onobrychisviciaefolia;germination;contamination

2014-10-21；

2015-01-04

甘肃省科技厅科技支撑计划项目(1104 NKCA087)资助

董文科(1990-)，男，甘肃金昌人，在读硕士。 E-mail：602105125@qq.com 马晖玲为通讯作者。

S 541

A

1009-5500(2015)02-0080-04