RNA干扰pygo2基因对人脑胶质母细胞瘤U251生物学行为及wnt通路的影响

傅建华，王海东，徐伟伟，周　孟，王世勇

(1.广州医科大学附属第五医院 神经外科,广东 广州 580001;

2.暨南大学附属第一医院 神经外科,广东 广州 580001)

RNA干扰pygo2基因对人脑胶质母细胞瘤U251生物学行为及wnt通路的影响

傅建华1，王海东2*，徐伟伟2，周孟2，王世勇2

(1.广州医科大学附属第五医院 神经外科,广东 广州 580001;

2.暨南大学附属第一医院 神经外科,广东 广州 580001)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0349)

pygo2基因是近年新发现的wnt信号系统中重要功能蛋白[1]，已有的研究结果表明pygo2与wnt信号及多种恶性肿瘤发生密切相关[2]，我们前期研究发现pygo2基因在脑胶质瘤中有高表达[3]，本研究拟采用RNAi技术敲除胶质瘤细胞中pygo2表达，研究pygo2表达下调对肿瘤细胞恶性表型的影响，以明确其与脑胶质瘤恶性发生之间的关系，为胶质瘤基因治疗提供新的靶点 。

1材料与方法

1．1材料

U251人脑胶质母细胞瘤细胞系购自中国科学院细胞库，siRNA-pygo2质粒由本实验室合成 ，转染剂lipofectamine购自美国invitrogene公司，羊抗人pygo2多克隆抗体(Santa Cruz，)， c-myc、p53 兔抗人多克隆抗体 (CST 公司)，GAPDH 、Cyclin D1 鼠抗人多克隆抗体 (Santa Cruz 公司)，辣根过氧化物酶标记的二抗 (Zymed，San Diego 公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养及实验分组①培养基及培养条件：含10%FBS的DMEM培养基，培养条件为37℃，5% CO2湿润培养。②实验分组：本实验所有指标检测都按照如下分组：空白对照组、无义序列siRNA组、转染pygo2 siRNA组(pygo2 siRNA)。使用lipofectamine2000 转染siRNA。反义 pygo2由上海吉玛制药公司合成。序列为5′-TGTTCGCACCTGTTACCTGCCACTAC-3′，无义序列为5′-GCACCAGACAAGCGGGGACAAAG-3′。方法见文献[4]。

1.2.2MTT法分析细胞增殖活性U251 细胞系接种于 96 孔板，转染siRNA 48 h 后使用 MTT 进行细胞增殖实验。酶标仪在 490 nm 处检测各孔吸光度值，数据取至少 6 个孔的均值。

1.2.3流式细胞技术分析细胞周期采用 FACS Calibur 流式细胞仪 (BectonDickinson，FranklinLakes，NJ，USA) 检测细胞周期，并通过 Modifit 软件 (Becton Dickinson)分析。实验重复3次。

1.2.4细胞侵袭分析Transwell小室侵袭实验步骤如下：实验采用8 μm孔径的transwell小室，小室的底部已用matrigel基质覆盖。首先将上述稳定转染pcDNA-pygo2的U251细胞(高表达pygo2)及其空白质粒对照细胞计数后种植于transwell小室中。孵育48 h后取出transwell小室， 将穿出小室位于膜下层的细胞进行固定和染色，显微镜下每孔随机取10视野计数后进行统计分析。实验重复 3 次。

1.2.5Western blot 分析U251 细胞系经对照、无关序列及反义 pygo2转染 48 h 后，收取样本用于 Western blot 分析。一抗为兔抗人抗 c-myc、鼠抗人 Cyclin D1(1∶1000 稀释)、β-catenin (1∶1000 稀释),结果通过Super-Signal 蛋白检测试剂盒 (Pierce，USA) 检测。

1.2.6统计方法所获的数据均使用SPSS软件进行统计分析。细胞周期用卡方检验，MTT、western blot、平板克隆及侵袭能力用方差分析，P<0.05被认为具有统计学意义。

2结果

2.1MTT结果

显示RNAi干扰pygo2表达后，细胞的增殖活性明显受到抑制。转染后3天，无义序列siRNA转染组细胞的生长未受到明显抑制，而pygo2 siRNA转染组细胞的生长在转染后第四天出现明显的生长抑制，且随时间的推移，抑制程度越发明显(图1)。

图1　MTT法测定不同组的细胞生长曲线

2.2细胞周期

流式细胞术检测细胞周期时相分布，发现对照组细胞G0/G1期、S期、G2/M期所占比例分别是48.8%、33.7%、18.9%,无义序列 siRNA转染组分别为47.7%、34.5%、16.1%。而siRNA pygo2转染组分别为65.8%、17.7%、14.2%。可见，pygo2表达敲低后出现细胞周期阻滞，从而延缓细胞周期进展，抑制细胞增殖(图2，3)。

图2　流式细胞仪记录不同组的细胞周期分布

图3　用流式细胞仪检测细胞周期分布

2.3细胞侵袭性生长受到抑制

Matrigel 侵袭生长实验可见对照组、mismatch siRNA组和pygo2 siRNA 干扰组细胞数分别为122.8±8.6、118.2±6.5和31.4±5.2，pygo2 siRNA组细胞数明显减少，与对照组和无义序列组相比差异显著(P<0.01)(图4)。

图4　干扰后第七天试验组与对照组相比细胞侵袭性明显下降

2.4western blot检测β-catenin、 cyclinD1表达

Western免疫印迹证实，与未转染组比较，pSUPER-pygo2能显著下调pygo2蛋白的表达(P<0.05),同时cyclinD1、c-myc的表达水平也下调(P<0.05)，但未能探及β-catenin表达变化(P>0.05)(图5)。

图5　各组细胞Pygo2,CyclinD1 和C-myc表达

3讨论

脑胶质细胞瘤简称胶质瘤，是神经系统高度恶性肿瘤，临床采用手术、放疗、化疗等综合治疗，效果均不理想。胶质瘤的发病原因目前尚不清楚，但有证据表明胶质瘤的形成与多种基因信号转导通路有关,如Wnt、TGF-β、Hedgehog、Notch等。其中以Wnt信号最为典型。Howng[5]等,研究显示wnt5a、wnt10b和wnt13在大多数脑肿瘤中高表达，而wnt1在各种肿瘤中低表达。 Pu[6]等发现wnt2、wnt5a 、Fz2在正常脑组织中无表达，而在脑胶质瘤中高表达，并且表达水平和肿瘤级别密切相关。Utsuki[7]等通过免疫组化检测45例脑胶质瘤中β-catenin，N-cadherin表达，发现其表达水平和肿瘤恶性程度密切相关。

Pygo2基因是wnt信号通路新发现的核心蛋白。 Barry[8]等通过对直肠癌细胞系进行Pygo基因的RNA干扰及补救实验，证实Pygo2是wnt信号中TGF介导的癌基因转录过程中不可缺少的。 我们前期报道了其在脑胶质瘤中的表达情况，发现其在恶性胶质瘤中显著高表达，并随着肿瘤恶性程度的增加而表达增强[3]。本研究通过U251细胞转染pygo2 siRNA表达质粒，有效的抑制了pygo2基因的表达，同时引起了细胞增殖能力减弱，相应的细胞周期阻滞。提示其在脑胶质瘤恶性演变中具有重要作用，可能是脑胶质瘤治疗的新的靶点。

CyclinD1是和细胞增殖有关的关键蛋白。我们研究发现，转染siRNA敲低U251细胞pygo2的表达后，cyclinD1表达下调，同时发现细胞周期阻滞于G0/G1期。

转染靶向pygo2的siRNA能有效降低其蛋白表达，并由此抑制了wnt靶基因cyclinD1、c-myc的表达，导致肿瘤细胞增殖能力和侵袭能力下降，我们同时检测了wnt信号关键调控基因β-catenin的表达变化，却未发现其表达受到抑制。该结果提示pygo2是wnt信号的下游蛋白，不依赖β-catenin来调控wnt信号下游靶基因的转录激活，pygo2抑制肿瘤细胞增殖的作用可能是通过降低wnt信号靶基因cyclinD1、c-myc表达实现的。这一发现和Pu[6]等的研究结果相似。

综上，本实验明确了pygo2在脑胶质瘤恶性演变中的作用及可能机制,针对pygo2的RNA干扰，在wnt信号的β-catenin下游水平对靶基因的表达产生调节作用，这些对于胶质瘤生物基因治疗的基因靶向策略具有重要意义。

参考文献：

[1]Barry Thompson,Fiona Townsley,Rina Rosin-Arbesfeld,et al.A new nuclear component of the Wnt signalling pathway [J].Nature cell biology,2002,5:367.

[2]Andrews PG,Lake BB,Popadiuk C,et al.Requirement of pygopus 2 in breast cancer[J].International Journal of Oncology,2007,30:357.

[3]王海东,杜天明,项永生,等.Wnt信号调控因子Pygo2在人脑胶质瘤中的表达及意义[J].中华神经外科疾病研究杂志，2010，13(6)：513.

[4]王海东,苏新辉,王占祥.Pygo2基因RNA干扰真核表达载体pSUPER.puro- Pygo2的构建[J].中华神经外科疾病研究杂志，2009，12(4)：121.

[5]Howng SL,Wu CH,Cheng TS,et al.Differential expression of wnt genes,β-catenin and E-caderin in human brain tumors[J].Cancer Lett,2002,183:95.

[6]P Pu,Z Zhang,C Kang,et al.Down regulation of wnt2 and β-catenin by siRNA suppresses malignant glioma cell growth[J].Cancer gene therapy,2009,16(4):351.

[7]Utsuki S，Sato Y，Oka H，et al．Relationship between the expression of E-，N-cadherins and beta-catenin and tumor grade in astrocytomas[J].Neurooncol,2002,57(3):1251.

[8]Lake BB,Kao KR.Pygopus is required for embryonic brain patterning in Xenopus [J].Dev Biol,2003,261(1):132.

[9]Andrews PG,Lake BB,Popadiuk C,et al.Requirement of Pygopus 2 in breast cancer [J].Int J Oncol,2007,30(2):357.

[10]Popadiuk CM,Xiong J,Wells MG,et al.Antisense suppression of pygopus 2 results in growth arrest of epithelial ovarian cancer[J].Clin Cancer Res,2006,12(7 Pt 1):216.

摘要：目的研究 pygo2在胶质瘤细胞系 U251中的表达、功能及作用机制。方法利用反义 pygo2转染 U251，下调 pygo2的表达，应用流式细胞术和 MTT 法，评价细胞生长、增殖、凋亡及周期变化；细胞克隆形成试验和transwell侵袭试验分析细胞的克隆形成能力和侵袭能力，采用Western 印迹法检测通路蛋白的表达变化。 结果转染反义 pygo2后，pygo2表达降低，MTT 结果显示转染反义 pygo2后细胞生长受到抑制且凋亡细胞增加；流式细胞术提示G1期到S期阻滞， 细胞克隆形成能力下降，侵袭能力均受到抑制，Western 结果表明wnt通路相关蛋白c-myc 和 Cyclin D1 在抑制pygo2表达后下降。结论pygo2可促进人脑胶质瘤细胞生长、增殖，可能是胶质瘤治疗的有效靶点，其发挥作用可能与 wnt 通路密切相关。

关键词：pygo2；胶质瘤;RNA干扰;wnt

RNA i down-regulate pygo2 to effect biological behavior of U251 and wnt passwayFUJian-hua,WANGHai-dong,XUWei-weietal.(NeurosurgeryDepartment,JinanUniversityAffiliatedFirstHospital,Guangzhou580001,China)

Abstract:ObjectiveTo study the expression,function and mechanism of pygo2 in the treatment for glioma cell line U251.MethodsAntisense pygo2 was used to transfect U251 and down regulate pygo2 expression,and flow cytometry and MTT were used to evaluate cell growth,proliferation,apoptosis and cell cycle changes.meanwhile，cell colony formation assay and invasion ability were tested,as well as westblotting was used to detetect changes of passway protein.ResultsAfter transfection of antisense pygo2,pygo2 was down regulated,MTT revealed cell proliferation was inhibited and apoptosis cells increased.flow cytometry revealed G1 to S stage arrest,both colony formation ability and invasion ability were inhibited,western blot showed wnt passway associated proteins,c-myc,cyclinD1 were decreased by knockdown of pygo2 e xpression.Conclusionpygo2 could promote growth,proliferation ，and was possibly an effective candidate for glioma treatment,the mechanism may be closely related with wnt signal passway.

Key words:pygo2;giloma;RNA i;wnt

收稿日期：(2014-05-24)

文献标识码：A

中图分类号：R739.41

文章编号：1007-4287(2015)03-0349-04

通讯作者*

基金项目：广东省卫生厅医学科研课题资助(A2012330)；暨南大学附属第一医院科研培育基金资助