甲状腺癌患者血浆miR-221的表达及临床意义

甲状腺癌患者血浆miR-221的表达及临床意义

徐升强

(武汉市第一医院 检验科,湖北 武汉430022)

本研究拟定量检测乳头状甲状腺癌患者外周血中miR-221水平，分析其作为乳头状甲状腺癌生物标志物的可行性。

1材料和方法

1.1标本采集

实验共收集本院住院部53例乳头状甲状腺癌患者，33例甲状腺良性结节患者，另外50例排除各种肿瘤的健康志愿者用于对照。所有纳入研究的个体都签署了知情同意书，经本院伦理委员会批准。乳头状甲状腺癌和甲状腺良性结节均经由病理切片诊断。乳头状甲状腺癌患者男5例，女48例，平均年龄38.6±6.9岁。甲状腺良性结节患者男6例、女27例，平均年龄40.2±7.3岁。健康对照组男15例，女35例，平均年龄37.4±8.2岁。清晨采集患者外周血2 ml，EDTA抗凝，3 000 g离心5 min，上清微量离心管再次12 000 g离心10 min，上清保存于-80℃备用。所有标本采集后4 h内处理完毕。

1.2MiRNA提取

采用miRcute miRNA提取试剂盒(天根生物技术公司，北京)按照说明书进行抽提血浆miRNA。400 μl血浆与等量的变性液混匀后加入5 μl合成的cel-miR-39(5fmol/μl)。Cel-miR-39被用于操作过程中的内参。最后用30 μl无RNA酶的水溶解miRNA。

1.3逆转录

用miRcute miRNA 单链cDNA合成试剂盒(天根生物技术公司，北京)合成miRNA的cDNA。加A反应在20 μl体系中进行：11.6 μl无RNA酶ddH2O，2 μl 10×逆转录缓冲液，0.4 μl Poly(A)聚合酶(5 U/μl)，4 μl 5×rATP溶液，2 μl miRNA。混匀后37℃反应60 min。取2 μl反应物用于逆转录，其余保存于-80℃。逆转录同样在20 μl体系中进行：11.5 μl 无RNA酶的ddH2O，1 μl RNasin(40 U/μl)，2 μl 10×RT缓冲液，2 μl 10×RT引物，1 μl dNTP混合物(每种2.5 mM)，0.5 μl Quant RTase，2 μl Poly(A)反应产物。混匀后37℃反应60 min。合成的cDNA保存于-80℃备用。

1.4定量RT-PCR分析

在20 μl体系中进行qRT-PCR反应：7.2 μl ddH2O，10 μl 2×miRcute miRNA 预混液(含SYBR和ROX)，0.4 μl逆转录引物(10 μM)，0.4 μl前向引物(10 μM)，2 μl cDNA。混合物被均分为两份。反应条件为：94℃ 2 min预变性后，40个循环于94℃ 2 s，60摄氏度34 s。反应在ABI step-one仪器上进行，仪器自动设定循环阈值(Ct)。miR-221的特异引物： GGGAGCTACATTGTCTGCTGGTTTC； U6b特异引物：ACGCAAATTCGTGAAGCGTT，cel-miR-39特异引物:CACCGGGTGTAAATCAGCTTG。B6b和cel-miR-39被用作内参。根据Tomasetti’s的描述，ΔCTmiR-221=CTmiR-221-CTU6b-CTcel-miR39，ΔCTmiR-221越高miR-221水平越低。SLE患者较正常对照miR-221的相对表达水平以2-ΔΔCT表示。每个定量反应设置复孔，结果取均值。

1.5统计学分析

miR-221的表达方式为均值±SD。通过Wilcoxon秩和检验对两组间均值进行比较。受试者工作曲线(ROC)分析诊断效率。P<0.05被认为有统计学意义。所有的统计分析采用SPSS13.0软件进行。

2结果

2.1miR-221在各研究组中的水平

乳头状甲状腺癌患者组miR-221水平显著高于正常对照组[-31.31±3.10 (95%CI:-30.28--32.34,P=0.035) versus -29.33±3.23(95%CI:-28.55—30.67),P=0.038]。乳头状甲状腺癌患者组miR-221平均水平约为正常对照组的3.71倍。乳头状甲状腺癌患者miR-221水平与甲状腺良性结节，甲状腺良性结节与正常对照的比较情况见图1。

2.2miR-221在甲状腺手术前后的水平

比较乳头状甲状腺癌手术前及术后一周血浆中miR-221水平发现，术后患者血浆miR-221水平显著下降[术前-31.31±3.10 (95%CI:-30.28--32.34,P=0.035) vs 术后-33.33±3.86(95%CI:-31.43—35.32),P=0.022]，手术后一周血浆miR-221水平下降约4.06倍(图2)。

2.3miR-221对乳头状甲状腺癌的诊断评价

ROC曲线下面积为0.75±0.06 (95%CI:0.63-0.88,P=0.01)(图3)。当miR-221检测以ΔCT=-30.27为临界值时，其敏感度为75.9%，特异度为62.1%。阳性预测值66.7%，阴性预测值72.0%。

图1血浆miR-221在各研究组间的水平。 图2乳头状甲状腺癌手术前后血图3血浆miR-221对乳头状甲状腺癌

乳头状甲状腺癌患者血浆miR-221浆miR-221水平。乳头状甲诊断作用的ROC分析

水平显著高于甲状腺良性结节及健状腺癌患者血浆miR-221水

康对照(P<0.05)，甲状腺良性结节平手术后显著下降(P<0.05)

患者与健康对照血浆miR-221水平

无显著差异(P>0.05)

3讨论

本研究中，我们通过实时定量逆转录PCR技术检测乳头状甲状腺癌患者血浆循环miR-221的水平。我们发现与甲状腺良性结节及健康对照者相比，乳头状甲状腺癌患者血浆miR-221水平显著增高(P<0.01)，手术后此miRNA水平显著下降(P<0.01)。乳头状甲状腺癌术后、甲状腺良性结节及健康对照者血浆miR-221水平无显著性差异(P>0.05)。

人miR-221定位于X染色体，其序列在各物种间高度保守。已有的研究发现miR-221在不同的肿瘤发病中具有不同的作用，在一些肿瘤中起抑制作用而在另一些肿瘤中则可能起刺激作用。细胞周期调剂蛋白p27 Kip1的编码基因被认为是miR-221的一个靶点，在胰腺癌、胃癌、甲状腺癌、乳腺癌、肝癌及肺癌细胞中， miR-221与p27 Kip1的表达呈负相关[5-7]，说明miR-221参与细胞周期的调节。miR-221在肿瘤细胞中可以同时调节多种肿瘤相关基因的表达从而达到对肿瘤发生协同刺激作用[8]。

自从发现循环miRNA在外周血中可以稳定存在，miRNA已被作为生物标志物进行广泛的研究。miRNA作为生物标志物具有多种优点[9]：①比mRNA稳定。miRNA在血浆中能够被较长时间的保存，并且对反复冻融等苛刻条件不敏感。②利于检测。当前对miRNA的实时定量检测技术已经比较成熟。较之对蛋白等生物标志物的检测，能够通过实时定量PCR检测的生物标志物具有更高的诊断敏感度和特异度。③miRNA在体内的功能十分丰富，对其进行高通量的定量分析，有利于及早全面了解机体健康状况。多项研究已经证实乳头状甲状腺癌组织中高表达miR-221。至今尚未见到miR-221作为乳头状甲状腺癌患者血浆生物标志物。本研究中，我们检测了乳头状甲状腺癌患者血浆循环miR-221水平，发现miR-221在乳头状甲状腺癌患者血浆中高表达(P<0.01)。血浆miR-221对乳头状甲状腺癌具有中等强度的诊断效能(AUC=0.75±0.06)。

总之，本研究检测了乳头状甲状腺癌患者手术前后、甲状腺良性结节及健康人血浆miR-221水平，分析其作为乳头状甲状腺癌生物标志物的特性。我们的数据提示miR-221在乳头状甲状腺癌患者血浆中高表达。对乳头状甲状腺癌具有中等强度的诊断效能，进一步可联合其他乳头状甲状腺癌的生物标志物来提高血浆miR-221对乳头状甲状腺癌的诊断效能。

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收稿日期：(2013-11-12)

文章编号：1007-4287(2015)03-0421-03