DNA甲基化在肝癌发生与发展中的作用及研究现状

曾 瑛综述，曾 斌审校

（南华大学附属第一医院消化内科，湖南衡阳421001）

DNA甲基化在肝癌发生与发展中的作用及研究现状

曾 瑛综述，曾 斌审校

（南华大学附属第一医院消化内科，湖南衡阳421001）

肝肿瘤； DNA甲基化； 遗传学，医学； 综述

肝脏是人体内最大的消化及内分泌器官，原发性肝癌（肝癌）具有易转移、侵袭性强的特点，是临床最常见的恶性肿瘤之一，5年生存率低，成为威胁人类生命第2名的恶性肿瘤。在我国，肝癌最主要的病因为病毒性肝炎，其中以乙型肝炎、丙型肝炎最常见，而在西方国家则以酒精性肝病为主。近年来不明原因的肝癌越来越多见，并呈年轻化趋势，随着对肝癌研究的深入，发现表观遗传学改变在肝癌发生中起核心作用，DNA甲基化、组蛋白修饰及miRNA表达异常均属于表观遗传学改变，而肝癌发生的核心环节主要与DNA异常甲基化相关。本文就近年来DNA甲基化改变与肝癌的相关研究作一综述。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶（DNMT）的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸为供体，将甲基基团转移到DNA CpG序列的胞嘧啶5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶的过程。DNMTs包括3种类型——DNMT1、DNMT2、DN MT3a/DNMT3b。DNMT1在细胞中含量最丰富，具有维持甲基化活性的作用；DNMT3家族主要起从头甲基化作用，使本来无甲基化的DNA双链发生甲基化，是催化DNA甲基化最重要、最关键的酶，与肿瘤的早期事件密切相关；DNMT2的作用还有待进一步研究。CpG岛超甲基化与抑癌基因的表达沉默有关，在肿瘤的早期发生过程中起重要作用；而肿瘤基因组普遍低甲基化与原癌基因的活化、染色质结构的改变、碱基丢失密切相关，并与肿瘤的浸润、转移、预后等有重要联系。已有大量研究证实，DNA甲基化改变与肝癌关系密切，而DNMTs作为甲基化过程中的中间媒介，其表达水平高低与DNA甲基化水平有重要关联。

2 DNA甲基化与肝癌的发生与发展

2.1 DNA低甲基化与肝癌 恶性肿瘤如胃癌[1]、乳腺癌[2]、前列腺癌[3]、结肠癌[4]等普遍存在DNA低甲基化，肝癌也是如此。Nishida等[5]研究发现，全基因组DNA低甲基化是早期肝癌形成的重要机制，同时也是非肝硬化肝癌早期染色质结构改变的重要原因。基因低甲基化主要发生在重复的DNA序列中，可激活处于沉默状态的DNA序列，如LINES和Alu等重复序列[6]，转移自身基因组位置，使其功能遭到破坏。有研究通过检测LINE-1基因的甲基化水平（13例健康人和50例肝癌患者）发现，肝癌患者LINE-1甲基化水平显著低于健康人，且其甲基化水平越低，肿瘤体积越大，分化水平越低，甲胎蛋白水平相对越高，患者1～2年生存率就越低[7]。Shen等[8]研究发现，53例肝癌患者中 AKT3、CD147、CCL20和SCGB1D1基因呈现低甲基化水平，且与肿瘤恶性程度具有相关性。最近研究发现，在肝癌的发生与发展过程中人胰岛素样生长因子-Ⅱ（IGF-Ⅱ）基因P4启动子低甲基化是一个早期和常见现象，在肝癌癌变过程中引起细胞染色体不稳定性增加，并且参与P4启动子表达激活[9]。多项研究发现，PAX4、HPA、VIM、uPA、c-myc基因低甲基化水平对肝癌的发生有促进作用[10-11]。DNA低甲基化激活了原癌基因Ras、myc等惰性基因的表达，研究发现，肝癌组织中c-myc和c-N-Ras普遍呈现低甲基化状态，从而诱发肝癌的发生。近年来，有研究发现，在正常细胞中表达沉默的Trks家族在肝癌组织中表达却上升，这与其在肝癌组织中启动子区甲基化水平显著降低相关，从而促进肿瘤的发生、存活、转移[12]。

2.2 DNA高甲基化与肝癌 在肝癌中，抑癌基因表达沉默、DNA修复功能丧失均与启动子CpG岛高甲机化密切相关，致使DNA损伤不能及时修复，从而发生细胞异常增生，这与肿瘤发生有着密切关系。Hua等[13]在44例肝癌组织中发现，p16基因的甲基化率为64.5%，而癌旁组织中只检出了5例，且p16基因高甲基化的患者术后复发风险显著升高，为肝癌根治术术后患者复发风险的评估提供了有力依据。Song等[14]、Shen等[8]采用定量甲基化特异PCR方法检测到在肝癌组织及肝癌细胞株中，SOX1、NFATC1、BMP4、CDKN2A等基因 CpG岛甲基化均呈高水平状态，从而影响肝癌的发生，且甲基化状态与肝癌的TNM分期显著相关。Liu等[15]对乙醇及病毒引起的肝癌进行检测，发现PAX5基因表达较正常组织明显下调，并发现PAX5启动子区存在高甲基化状态，可能是其表达下调的主要原因。Choi等[16]采用甲基化特异性PCR及杂合性缺失研究等方法，发现39例肝癌中有22例RIZI基因启动子区呈现高甲基化，Lv等[17]研究表明，BTG3在肝癌组织中表达下调，与启动子区高甲基化相关，2个实验研究发现，RIZI和BTG3启动子区甲基化水平越高，越容易发生远处转移，肝癌恶性程度越高，肿瘤体积相对越大，患者总存活率越低。P16INK4a是Rb信号通路中一种重要周期调控蛋白，有研究发现，其在肝癌中表达缺失，且其启动子区CpG岛甲基化率显著高于慢性活动性肝炎及肝硬化组，结果表明，其表达缺失是启动子区异常甲基化所致[18]。总之，大量研究证实抑癌基因表达沉默与DNA甲基化关系密切，是肝癌发生的重要表观遗传学改变。

2.3 DNMTs与肝癌 研究表明，DNMT在多种肿瘤细胞中表达增高、活性增强，而在DNA甲基化改变中起催化作用的甲基转移酶包括DNMT1、DNMT3a/3b。普遍认为，从头甲基转移酶在肿瘤发生过程中较维持甲基转移酶更为重要。李宏涛等[19]采用实时定量PCR检测DNMT的表达情况，发现DNMT1、DNMT3b在MHCC97L、SMMC742、BEL7402、MHCC97M3和HepG25种肝癌细胞系中均呈高表达，且发现DNMT3a的表达水平越高，肝癌细胞系的远处转移能力可能越低。Qin等[20]发现，在55例肝癌组织中DNMT1表达水平均升高，且与门脉癌栓、肿瘤细胞分化高低及患者生存率相关。有学者报道，在大鼠肝癌模型中发现DNMT1及DNMT3b具有协助作用，均能促进抑癌基因启动子区高甲基化，并与肝癌组织浸润性生长及门静脉癌栓形成有关[21]。Mandrekar等[22]研究发现，在癌旁组织、肝硬化组织及肝癌组织中，DNMTs表达逐渐升高，DNMTs种类也逐渐呈多样化趋势。Kanai等[23]研究发现，与癌旁组织相比，肝癌组织中DNMT表达水平显著升高，导致DNA高甲基化，从而诱导原发性肝癌的发生。

3 DNA甲基化与肝癌的治疗

因表观遗传学有可逆性，目前抑制抑癌基因DNA高甲基化水平，恢复其表达成为抗肿瘤药物研发的主攻方向。目前研究较为广泛的5-氮杂胞苷类制剂，已被批准用于骨髓异常综合征的临床治疗。这类核苷类抗代谢药通过竞争性结合DNMT结合位点而形成稳定的共价键，从而达到抑制甲基转移酶活性的作用。近来Tao等[24]采用RT-PCR及Western blotting检测SMMC-7721肝癌细胞株相关抑癌基因的端粒酶活性，发现使用5-Aza-CR处理过的肝癌中端粒酶活性明显下降，且hTERET启动子区出现了去甲基化，使相关抑癌基因重新表达，诱导肝癌细胞的凋亡。Venturelli等[25]发现，5-Aza-CR具有双重抗肿瘤效应，不仅能够恢复肿瘤甲基化异常状态，而且使肿瘤对凋亡诱导物质（如肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体）具有增敏性，为其抗肿瘤作用提供了分析依据。其次像氨基苯甲酸类，如普鲁卡因胺，是一种非核苷酸类甲基转移酶抑制剂，研究表明普鲁卡因胺能使肝癌细胞株HepG2高甲基化的GSTP基因去甲基化重新表达，盐酸普鲁卡因主要通过干扰DNA与DNMT1的结合位点，使超甲基化的CpG岛去甲基化，继而发挥治疗肿瘤的作用。临床试验研究表明，普鲁卡因胺的不良反应相对较小，但由于其对心脏的不良反应，而限制了临床应用。另有肼类，代表药物肼屈嗪，Song等[26]研究发现，经过肼屈嗪处理过的宫颈癌细胞中，抑癌基因APC表达明显上调，且发现，肼屈嗪对多药耐药实体肿瘤有益。绿茶中含有丰富的茶多酚类，研究发现其具有去甲基化作用，不仅通过竞争抑制DNMT1的催化结合位点，从而抑制DNA甲基化，而且能使p16、hMLH1、06-MGMT基因的甲基化逆转，使其激活；现已被食品药品监督管理局批准应用于临床，用于肿瘤治疗前景可观。近年来研究发现，Zebularine、Psammaplin A均具有抑制DNMT活性，诱导肿瘤细胞凋亡的作用。其中Zebularine也属于核苷类制剂，有研究发现，Zebularine能激活RASSF1A、CIS等多个抑癌基因的表达，促进肝癌细胞凋亡，抑制其生长，且该药在联合抗肿瘤治疗中不会使p16基因重新甲基化，可用于长期维持治疗[27]。Zebularine具有毒性反应少、结构稳定、可口服等优点，易于患者接受，临床应用前景广泛。其他如姜黄素、雷公藤、三氧化二坤等药物[28-29]均发现有抑制DNA甲基化作用，具有抗肿瘤效应。

4 展 望

近年来DNA甲基化的研究进展迅速，为多种基因的甲基化与肝癌的早期诊断、预后及治疗提供了一定的理论依据，但需要更多临床样本进行验证和研究。肝癌的发生是多因素参与的复杂过程，还有许多问题待进一步研究，如组蛋白修饰及miRNA的表达异常、甲基化与染色质重构的关系等。此外，目前去甲基化药物在临床应用上不够成熟，药物的剂量、给药途径、毒性反应及确切疗效仍不十分清楚，因此，在临床上还需寻找特异性更强、敏感性更高的甲基化基因，研究不良反应更低的去甲基化药物，更早实现肝癌的分子靶向治疗；但DNA去甲基化药物也可能造成基因组不稳定，存在其他组织潜在癌变风险，如何防范和避免是需深入研究的问题。

[1]Compare D，Rocco A，Liguori E，et al.Global DNA hypomethylation is an early event in Helicobacter pylori-related gastric carcinogenesis[J].J Clin Pathol，2011，64（8）：677-682.

[2]Portela A，Esteller M.Epigenetic modifications and human disease[J].Nat Biotechnol，2012，28（10）：1057-1068.

[3]Yang B，Sun H，Lin W，et al.Evaluation of global DNA hypomethylation in human prostate cancer and prostatic intraepithelial neoplasm tissues by immunohistoc hemistry[J].Urol Oncol，2013，31（5）：628-634.

[4]Siegel R，Ward E，Brawley O，et al.Cancer statistics，2011：the impact of elim-inating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths[J].CA Cancer J Clin，2011，61（4）：212-236.

[5]Nishida N，Kudo M，Nishimura T，et al.Unique association between global DNA hypomethylation and chromosomal alterations in human hepatocellular carcinoma[J].PloS One，2013，8（9）：e72312.

[6]De Smet C，Loriot A.DNA hypomethynation in cancer：Epigenetic scars of a neoplastic journey[J].Epigenetics，2010，5（3）：206-213.

[7]Ramzy II，Omran DA，Hamad O，et al.Evaluation of serum LINE-1 hypomethylation as a prognostic maker for hepatocelluar carcinoma[J].Arab J Gastroenterol，2011，12（3）：139-142.

[8]Shen J，Wang S，Zhang YJ，et al.Genome-wide DNA methylation profiles in hepatocelluar carcinoma[J].Hepatology，2012，55（6）：1799-1808.

[9]Dong ZZ，Yao M，Qian J，et al.Abnormal expression of insulin-like growth factor-IIandinterveningofitsmRNAtranscriptioninthepromotionofHepG2 cell apoptosis[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2013，93（12）：892-896.

[10]Hanahan D，Weinberg RA.Hallmarks of cancer：the next generation[J]. Cell，2011，144（5）：646-674.

[11]Pogribny IP，Rusyn I.Role of epigenetic aberrations in the developemet and progression of human hepatocellular carcinoma[J].Cance Lett，2014，342（2）：223-230.

[12]Jin W，Lee JJ，Kim MS，et al.DNA methylation-dependent regulation of TrkA、TrkB and TrkC genes in human hepatocellular carcinoma[J].Biochem Biophys Res Commun，2011，406（1）：89-95.

[13]Hua D，Hu Y，Wu YY，et al.Quantitative methylation analysis of multiple genes using methylation-sensitive restriction enzyme-basedquantitative PCR for the detection of hepatocellular carcinoma[J].Exp Mol Pathol，2011，91（1）：455-460.

[14]Song MA，Tiirikainen M，Kwee S，et al.Elucidating the landscape of aberrant DNA methylation in hepatocellular carcinoma[J].PloS One，2013，8（2）：e55761.

[15]Liu W，Li X，Chu ES，et al.Paired box gene 5 is a novel tumor suppressor in hepatocellular carcinoma through interaction with p53 signaling pathway[J].Hepatology，2011，53（3）：843-853.

[16]Choi HN，Bae JS，Jamiyandorj U，et al.Expression and role of SIRT1 in hepatocellular carcinoma[J].Oncol Rep，2011，26（2）：503-510.

[17]Lv Z，Zou H，Peng K，et al.The suppressive role and aberrent promoter methylation of BTG3 in the progression of hepatocelluar carcinoma[J]. PloS One，2013，8（10）：e77473.

[18]Ahmed R，Salama H，Fouad A，et al.Detection of aberrant p16INK4A methylation in sera of patients with HCV-related liver diseases：An Egyptian study[J].Med Sci Monit，2010，16（9）：CR410-415.

[19]李宏涛，梁后杰，李文梅，等.肝癌细胞系中DNA甲基转移酶和HLA1类分子的表达及意义[J].中华肿瘤防治杂志，2010，17（5）：1141-1143.

[20]Qin W，Leonhardt H，Pichler G.Regulation of DNA methyltransferase 1 by interactions and modifications[J].Nucleus，2011，2（5）：392-402.

[21]Medina-Franco JL，Caulfield T.Advances in the computational developmentofDNAmethyltransferaseinhibitors[J].DrugDiscov，2011，16（9/10）：418-425.

[22]Mandrekar P.Epigenetic regulation in alcoholic liver disease[J].World J Gastroenterol，2011，17（20）：2456-2464.

[23]Kanai Y.Genome-wide DNA methylation profiles in precancerous conditions and cancers[J].Cancer Sci，2010，101（1）：36-45.

[24]Tao SF，Zhang CS，Guo XL，et al.Anti-tumor effect of 5-aza-2′-deoxycytidine by inhibiting telomerase acitvity in hepatocelluar carcinoma cells[J]. World J Gastroenterol，2012，18（19）：2334-2343.

[25]Venturelli S，Berger A，Weiland T，et al.Dual antitumour effect of 5-azacytidine by inducing a breakdown of resistance-mediating factors and epigemetic modulation[J].Gut，2011，60（2）：156-165.

[26]Song Y，Zhang C.Hydralazine inhibits human cervical cancer cell growth in vitro in association with APC demethylation and reexpression[J].Cancer Chemother Pharmacol，2009，63（4）：605-613.

[27]Daniunaite K，Berezniakovas A，Jankevicius F，at al.Frequent Methylation of RASSF1 and RARB in Urine Sediments From Patients with Early Stage Prostate Cancer[J].Medicina（Kaunas），2011，47（3）：147-153.

[28]Liu Z，Xie Z，Jones W，et al.Curcumin is a potent DNA hypomethylation agent[J].Bioorg Med Chem Lett，2009，19（3）：706-709.

[29]Yang L，Luo JM，Wen SP，et al.Effect of As2O3 on demethylation of SHP-1 gene in human lymphoma cell line T2[J].Ai Zheng，2009，28（3）：249-254.

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.08.019

：A

：1009-5519（2015）08-1173-03

2014-11-17）

曾瑛（1988-），女，湖南益阳人，硕士研究生，主要从事医学临床工作；E-mail：306712932@qq.com。