肠神经嵴干细胞发育与先天性巨结肠关系研究

尚 卿综述，刘远梅审校（遵义医学院附属医院小儿普胸泌外科，贵州遵义563099）

肠神经嵴干细胞发育与先天性巨结肠关系研究

尚 卿综述，刘远梅审校
（遵义医学院附属医院小儿普胸泌外科，贵州遵义563099）

干细胞； 肠神经系统； Hirschsprung病； 胚胎发育； 综述

先天性巨结肠（HD）也称为先天性肠无神经节细胞症，是小儿外科常见的消化道畸形，普遍认为其主要发病机制与胚胎时期肠神经嵴干细胞（ENCCs）迁移、发育、存活异常有关[1]，且与造成正常肠神经系统（ENS）发育异常有关。HD的发病机制尚未完全明了，国内外均对其发病原因进行了大量研究，普遍认为，ENCCs发育异常是HD发病的主要原因之一，现将影响ENCCs发育的因素综述如下，进一步探讨HD的病因。

1 ENCCs的正常发育形成完整的ENS

ENCCs起源于迷走神经和骶神经的胚胎轴区域。迷走神经嵴细胞最终定植在前肠、中肠和后肠，而骶神经嵴细胞迁移定植到远端肠管。在小鼠胚胎，迷走神经嵴细胞于胚胎8.5 d开始迁移，于胚胎14.5 d结束，迁移大约需6 d[2]；在人类胚胎，ENCCs的迁移于胚胎4周时开始，结束于胚胎7周，大约花费3周[3]。最开始普遍认为，ENCCs必须通过盲肠部分可定植于后肠。但Nishiyama等[4]对小鼠胚胎ENCCs延迟成像的研究显示，胚胎10.5～11.5 d，中肠和后肠呈反向平行，这时，ENCCs可通过二者间的肠系膜以单细胞的形式从中肠迁移至后肠，并且这些通过肠系膜迁移的ENCCs是组成后肠ENS的主要来源。此外，有研究表明，ENCCs定植到肠管各处后并非是一动不动的，单个细胞存在一个无目的的迁移[5]，甚至有由远端向近端，呈相反方向的迁移运动，这种现象可能是ENCCs在肠管内保持密度均匀的一种机制。另外，有学者认为，小鼠胚胎10.5～14.5 d存在一个限制期，当ENCCs未及时通过肠系膜迁移时，后肠的定植就会受到影响。但Barlow等[6]研究表明，即使胚胎14.5 d后也存在ENCCs的定植，这说明可能不单只有一个控制ENCCs迁移的限制期。目前，单纯的迁移延迟已经不能完全阐明HD的发病机制，而且ENS的形成也不单单只受到ENCCs增殖、分化的影响，还受到肠道内环境的影响[7-8]。无论ENCCs在哪一环节上出现异常，都将导致ENS的发育缺陷，进而可能引起HD发生。

2 影响ENCCs发育的肠道内遗传学因素

2.1 受体酪氨酸激酶（RET）和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF） RET和GDNF是引起HD最主要的基因。在散发HD病例中（家族成员中只有1例HD患者）RET基因的突变率达15%～35%，而家族病例中达50%。GDNF是一种分泌蛋白，与GDNF家族受体α1（GFRα1，一种锚定在细胞表面的磷脂酰肌醇糖基化的蛋白）结合形成复合物，可以结合并激活跨膜RET。然后RET自身磷酸化激活下游通路，从而调节ENCCs增殖、存活、凋亡、迁移和分化。

在ENCCs迁移进入胚肠前，GDNF在中胚层即有表达。当其迁移入胚肠时，即开始表达RET和GFRα1；当ENCCs到达食道位置时，GDNF已经在胃表达；而当ENCCs迁移至远端小肠时，GDNF已经在盲肠表达[8]，表明GDNF的作用可能是促进RET和GFRα1的表达，使ENCCs迁移至正确位置，如果后肠无GFRα1表达的话，ENCCs则不能离开中肠。近期，一种新的RET基因突变小鼠，表现为ENCCs通过肠系膜从中肠迁移至后肠时发生延迟和破坏，引起肠神经节细胞减少症[4]，这说明RET对ENCCs跨肠系膜迁移也起到调节作用。但需要注意的是，ENCCs迁移的延误或数量的减少并不会必然导致肠道神经节细胞的缺如，其不足的细胞数可以通过局部神经嵴细胞的增殖和分化来代偿[6-7]。无论基因突变是在RET、GDNF或GFRα1任何一处，只要GDNF-GFR α1-RET复合体功能缺陷，就可能导致无神经节细胞症。

2.2 内皮素通路 内皮素因子3（EDN3或ET3）是一种肠道间质细胞分泌的多肽，可以与内皮素B型受体（EDNRB）结合，并通过内皮素转换酶1（ECE1）的修饰形成只有21个残基大小的活性形式。EDN3-EDNRB信号通路参与调节ENCCs的正常迁移并维持肠神经干细胞的增殖状态[9]，抑制ENCCs的分化。

EDN3基因、EDNRB基因和ECE1基因突变小鼠均表现出不同程度的ENCCs迁移缺陷，造成远端肠管ENS的缺如。对EDNRB的进一步研究发现，在条件性敲除EDNRB基因的研究中发现，EDN3-EDNRB信号通路的关键期在胚胎10.5～12.5 d，而且EDNRB缺失和EDN3缺失小鼠只在远端结肠上表现为肠无神经节细胞症，推测EDN3-EDNRB信号通路可能在神经节细胞迁移的后期起重要作用。在正常小鼠的胚胎14.5 d，ENCCs已经完全迁移至整个小鼠肠道，而对于EDNRB突变小鼠，ENCCs的迁移较正常小鼠要晚24 h，而且ENCCs迁移方向改变的同时速度也降低[10]。最近，Evangelisti等[11]研究发现，载脂蛋白B（ApoB）是GDNF/RET

和EDN3/EDNRB通路调控ENCCs的一个新靶点，可能与ApoB介导肠管内Hu蛋白D型（HuD）蛋白的表达有关，这为将来进一步研究ENCCs的特性提供了新的着手点。

2.3PHOX2B基因 PHOX2B基因可以编码一种与神经发育有关的转录因子，在ENCCs迁移过程中、肠神经元和胶质细胞中均有表达[12]。PHOX2B基因缺失的小鼠和斑点鱼动物模型表现为全肠段的无神经节细胞症[13]，且在该突变小鼠的无神经节肠管内无RET的表达。在人体中，多聚丙氨酸延展突变是PHOX2B基因最常见的突变类型，临床表现为先天性中枢性肺换气不足综合征（CCHS），同时合并有HD的发生，且丙氨酸延展越长，其HD表型也越严重[14]。其发生机制可能与PHOX2B基因和SOX10基因之间互相调节失衡，导致自主神经节发育异常有关[15]。

2.4 SOX10基因 SOX10基因也是一种转录因子，迷走神经嵴细胞从神经管内迁出时可表达SOX10，在ENCCs迁移过程中持续表达，并维持ENS前体细胞的活性。SOX10纯合突变的小鼠表现为ENS和黑色素细胞的异常，这种小鼠“ENS前体细胞池”的细胞数相较正常小鼠明显减少，且整个肠道均缺乏神经元细胞。迷走神经嵴细胞在迁移入肠前就已经死亡，所以该突变小鼠一出生就将死亡。人类SOX10基因突变表现为瓦登伯革综合征，无神经节细胞症就是其中一种表型。Nagashimada等[15]在研究“CCHS-HD-神经细胞瘤”联合动物模型时，通过引入一个重复扩展突变的基因至小鼠的PHOX2B基因表位，使得突变胚胎肠道神经节前体中SOX10基因持续表达，降低了ENCCs的扩增和向胶质细胞分化的能力。说明SOX10基因和PHOX2B基因的相互调控可能是维持ENCCs向神经元和胶质细胞定向分化的关键。Watanabe等[16]将SOX10基因突变小鼠和整合素β1（ITGB1）基因突变小鼠杂交后发现，SOX10基因的过多或过少表达同样会影响ENCCs的定植能力，原因可能是SOX10基因表达的改变影响了整合素β1亚单位（一种重要的细胞外基质受体）的表达有关。这同样也说明细胞外环境的改变，也将会影响ENCCs的迁移、定植。

2.5 CXCR4基因 CXCR4是基质细胞衍生因子1（SDF-1）的特异受体，位于细胞表面，表达于血管内皮细胞。CXCR4基因敲除小鼠表现为胃肠道大血管的形成缺陷，同时，这些小鼠在胚胎11.5 d通过肠系膜迁移的ENCCs数量减少，且在胚胎14.5 d相较于正常小鼠定植于后肠的ENCCs显著减少[4]，暗示经肠系膜迁移的ENCCs可能受到血管源性信号通路的部分影响。但最近Delalande等[17]认为血管网络的发育对ENCCs的迁移无引导作用，甚至从最开始二者间就是独立存在的，因此血管源信号通路与HD的关系仍需进一步研究。

2.6DNA甲基转移酶3B（DNMT3B）DNMT3B是哺乳动物体内的DNA重新甲基化酶之一，在建立和维持个体DNA甲基化模式的过程中起到了非常重要的作用。尽管已有研究证明，DNMT3B与颅ENCCs的发育无关[18]，但Torroglosa等[19]于体外分离培养HD患者和健康人的ENCCs后发现，后者ENCCs神经球的DNMT3B基因mRNA及蛋白表达量较健康组明显下降，而Nestin（一种神经干细胞标记物）的表达较健康组明显增高，这说明HD患者的ENCCs分化能力也相应下降。同时，其研究还证实，HD患者ENCCs的FN1基因、LAMC1基因及PAX6基因表达也显著下调，而PAX6低表达会降低细胞增殖能力[20]，高表达将促进神经细胞的分化[21]。可以看出，异常的DNA甲基化模式可能调节ENCCs的发育，参与HD的发病，对DNMT3B联合其他HD相关基因的研究也将进一步阐明HD的病理机制。

3 影响ENCCs发育的肠道内局部微环境因素

目前普遍认为，HD为一多基因异常导致的疾病，但遗传学因素尚不能完全阐明HD的发病，大多数学者认为，肠道内局部微环境的改变也可影响ENS的正常发育。肠道神经节细胞是由ENCCs发育而来，而局部微环境的改变影响ENCCs的正常迁移及分化，是HD发生的主要非基因学病因之一。

3.1 维生素A 维生素A（又称视黄醇）是一种人体必需的维生素，其活性形式维甲酸（RA）在胚胎发育中起重要作用。不足或过量地摄入维生素A均会导致胎儿先天缺陷，甚至造成死胎。最近研究显示，敲除RBP4基因小鼠模型和敲除RALDH2基因小鼠模型[22]可能为HD的发病机制提供新的方向。该2种小鼠的肝脏不能保存维生素A，在胚胎7.5 d时开始对孕鼠行无维甲酸饮食，胎鼠将完全耗尽维生素A及维甲酸。RBP4基因缺陷小鼠表现为轻度的维甲酸缺乏伴远端肠管神经节细胞缺失症，同时存在磷酸酶的增高和张力蛋白同源物（PTEN）的聚集，后者的堆积将降低ENCCs的迁移速度。因此，RA被认为可能通过维持ENCCs迁移过程中伪足的形成，从而保持ENCCs的持续迁移。这也表明，维生素A的缺乏可能是引起HD的非遗传危险因素。RALDH2基因缺陷小鼠通常于胚胎9.5 d左右死亡，早于ENS的发育。但是，如果从胚胎7.5 d开始对孕鼠添加维甲酸饮食处理，则胎鼠存活的时间大大延长，同时也表现出肠神经节细胞发育不良。尽管上述的小鼠模型表明，维甲酸信号通路可能参与HD的发病，但无论哪种基因缺陷小鼠，其HD的表现均存在部分人为干预的因素，因此维甲酸对ENCCs迁移的具体机制仍有待探索。

3.2 骨形成蛋白（BMPs） BMPs属于转化生长因子β（TGF-β）超家族，是一种广泛的调节因子，对胚胎期的细胞增殖、分化、凋亡和器官发育上均起作用。已有研究指出，BMPs及其相关的信号分子在ENCCs迁移及ENS神经节形成过程中起作用[23]，最近发现低浓度的BMPs可提高神经元数量，反之，高浓度的BMPs会减少肠道神经元的数量，可能与BMPs限制肠道神经前体细胞的增殖有关。Wu等[24]实验发现，在HD患者狭窄段肠管，BMP2、BMP5、BMP10表达显著增加，说明这些蛋白与HD的发生有密切关系。但目前BMPs引起HD的具体机制尚不清楚，对其更深的研究可能会为治疗HD提供一个新靶点。

3.3 细胞粘合素C（TNC） TNC也叫肌腱蛋白C，是一种细胞外基质蛋白。Akbareian等[25]发现，在禽类胚胎发育过程中，当ENCCs到达盲肠区前，几乎不表达TNC。一旦ENCCs通过盲肠进入后肠时，就会在ENCCs周围大量表达。其进一步研究表明，ENCCs自身也产生TNC，而这种细胞外基质蛋白通过修正局部的内环境促进其迁移能力。此外，只有迷走神经嵴来源的ENCCs表达TNC，而骶神经嵴来源的ENCCs不表达这种蛋白，其原因尚不明了。可以猜想，胚胎期该蛋白表达异常将会影响正常ENS的发育，成为HD发生的危险因素之一。

综上所述，HD是一个复杂的疾病，其遗传机制也异常复杂，且胚胎期肠道微环境的异常也参与了HD的发病。虽然已有大量的针对HD病因的研究，但单纯的遗传学原因不能完全解释HD的发病机制，仍需进一步研究探索更多HD相关的遗传和非遗传因素。对于HD患者基因外显子甚至是整个基因组序列的检测，可能是一种理想的方式来确定是哪些基因的突变会引发HD。同时，对于肠道微环境及环境因素对ENS的影响也不能忽略。肠神经干细胞移植治疗HD一直被认为可能是一种彻底治愈HD的理想方法，目前已有将患者自身提取的肠神经干细胞进行基因修饰后移植治疗HD的报道[26]，因此研究新的HD动物模型、更深入的筛选、鉴定与HD发病有关的人类基因，并尝试去发现这些基因突变后对ENS的影响，也将对未来HD的临床诊断、治疗，甚至对高危人群的HD预防起到积极作用。

[1]Parisi MA，Kapur RP.Genetics of Hirschsprung disease[J].Curr Opin Pediatr，2000，12（6）：610-617.

[2]Newgreen D，Young HM.Enteric nervous system：development and developmental disturbances—part 2[J].Pediatr Dev Pathol，2002，5（4）：329-349.

[3]Druckenbrod NR，Epstein ML.The pattern of neural crest advance in the cecum and colon[J].Dev Biol，2005，287（1）：125-133.

[4]Nishiyama C，Uesaka T，Manabe T，et al.Trans-mesenteric neural crest cells are the principal source of the colonic enteric nervous system[J].Nat Neurosci，2012，15（9）：1211-1218.

[5]Young HM，Bergner AJ，Simpson MJ，et al.Colonizing while migrating：how do individual enteric neural crest cells behave?[J].BMC Biol，2014，12：23.

[6]Barlow AJ，Dixon J，Dixon MJ，et al.Balancing neural crest cell intrinsic processes with those of the microenvironment in Tcof1 haploinsufficient mice enables complete enteric nervous system formation[J].Hum Mol Genet，2012，21（8）：1782-1793.

[7]Barlow AJ，Dixon J，Dixon M，et al.Tcof1 acts as a modifier of Pax3 during enteric nervous system development and in the pathogenesis of colonicaganglionosis[J].Hum Mol Genet，2013，22（6）：1206-1217.

[8]Natarajan D，Marcos-Gutierrez C，Pachnis V，et al.Requirement of signalling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous systemprogenitor cells during mammalian embryogenesis[J]. Development，2002，129（22）：5151-5160.

[9]Druckenbrod NR，Powers PA，Bartley CR，et al.Targeting of endothelin receptor-B to the neural crest[J].Genesis，2008，46（8）：396-400.

[10]Druckenbrod NR，Epstein ML.Age-dependent changes in the gut environment restrict the invasion of the hindgut by enteric neural progenitors[J]. Development，2009，136（18）：3195-3203.

[11]Evangelisti C，Bianco F，Pradella LM，et al.Apolipoprotein B is a new target of the GDNF/RET and ET-3/EDNRB signalling pathways[J].Neurogastroenterol Motil，2012，24（10）：e497-508.

[12]Corpening JC，Cantrell VA，Deal KK，et al.A Histone2BCerulean BAC transgene identifies differential expression of Phox2b in migrating enteric neural crest derivatives and enteric glia[J].Dev Dynamics，2008，237（4）：1119-1132.

[13]Elworthy S，Pinto JP，Pettifer A，et al.Phox2b function in the enteric nervous system is conserved in zebrafish and is sox10-dependent[J].Mech Dev，2005，122（5）：659-669.

[14]Kwon MJ，Lee GH，Lee MK，et al.PHOX2B mutations in patients with Ondine-Hirschsprung disease and a review of the literature[J].Eur J Pediatr，2011，170（10）：1267-1271.

[15]Nagashimada M，Ohta H，Li C，et al.Autonomic neurocristopathy-associated mutations in PHOX2B dysregulate Sox10 expression[J].J Clin Invest，2012，122（9）：3145-3158.

[16]Watanabe Y，Broders-Bondon F，Baral V，et al.Sox10 and Itgb1 interaction in enteric neural crest cell migration[J].Dev Biol，2013，379（1）：92-106.

[17]Delalande JM，Natarajan D，Vernay B，et al.Vascularisation is not necessary for gut colonisation by enteric neural crest cells[J].Dev Biol，2014， 385（2）：220-229.

[18]Jacques-Fricke BT，Roffers-Agarwal J，Gammill LS.DNA methyltransferase 3b is dispensable for mouse neural crest development[J].PLoS One，2012，7（10）：e47794.

[19]Torroglosa A，Enguix-Riego MV，Fernández RM，et al.Involvement of DNMT3B in the pathogenesis of Hirschsprung disease and its possible role as a regulator of neurogenesis in the human enteric nervous system[J]. Genet Med，2014，16（9）：703-701.

[20]Balmer NV，Weng MK，Zimmer B，et al.Epigenetic changes and disturbed neural development in a human embryonic stem cell-based model relating to the fetal valproate syndrome[J].Hum Mol Genet，2012，21（18）：4104-4114.

[21]Jang ES，Goldman JE.Pax6 expression is sufficient to induce a neurogenicfate in glial progenitors of the neonatal subventricular zone[J].PLoS One，2011，6（6）：e20894.

[22]Fu M，Sato Y，Lyons-Warren A，et al.Vitamin A facilitates enteric nervous system precursor migration by reducing Pten accumulation[J].Development，2010，137（4）：631-640.

[23]Chalazonitis A，Kessler JA.Pleiotropic effects of the bone morphogenetic proteins on development of the enteric nervous system[J].Dev Neurobiol，2012，72（6）：843-856.

[24]Wu M，Chen W，Mi J，et al.Expression analysis of BMP2，BMP5，BMP10 in human colon tissues from Hirschsprung disease patients[J].Int J Clin Exp Pathol，2014，7（2）：529-536.

[25]Akbareian SE，Nagy N，Steiger CE，et al.Enteric neural crest-derived cells promote their migration by modifying their microenvironment through tenascin-C production[J].Dev Biol，2013，382（2）：446-456.

[26]Shu X，Meng Q，Jin H，et al.Treatment of aganglionic megacolon mice via neural stem cell transplantation[J].Mol Neurobiol，2013，48（3）：429-437.

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.08.016

：A

：1009-5519（2015）08-1164-04

2014-12-05）

贵州省科学技术基金项目（黔科合J字[2012]2364号）。

尚卿（1990-），男，河南新乡人，硕士研究生，主要从事小儿普外科临床工作；E-mail：pal40276292@163.com。

刘远梅（E-mail：yuanmei116@aliyun.com）。