酶联免疫吸附试验操作关键点

张瑞娴，吴有全，郑雪莲，李炜煊（佛山市第一人民医院检验科，广东528000）

酶联免疫吸附试验（ELISA）是酶免疫测定方法中应用最广的技术，既可用于定性，又可用于定量检测。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原-抗体反应在固相表面进行，通过洗涤去除未与固相载体结合的游离成分，加底物显色进行测定。ELISA 具有操作简单，灵敏度高，特异性好，广泛应用于临床免疫检验，是医学检验实习生必须掌握的最基本的试验操作。ELISA 在操作过程中有很多需要注意的事项，现将作者在日常带教中认为的关键点及如不慎加入孔外则注意事项总结如下。

1 实习前的培训

实习生在进行ELISA 操作前首先阅读相应项目的操作规程，本科免疫室使用ELISA 法的项目有11 个，每个试验的操作规程都不一样，要求每位实习生熟悉每个项目的操作规程，需要每位实习生多花时间和付出一定的努力，做好这项工作对后面的操作起到很大的作用。

2 试验过程中带教的注意事项

本科免疫室使用ELISA 方法的试验很多，以下是ELISA 操作过程中的一些注意事项。试剂从冰箱取出后，必须在室温放置30 min[1]再进行检测，试剂使用前应摇匀，尽量避免有溶血、黄疸、脂血或被微生物污染的标本[2]。加样前要求学生先检查标本状态，对不合格标本退回并要求重抽。用全自动加样系统，标本加完后要求学生注意是否有漏加的情况，如果漏加了，则用加样器补上。加酶结合物和底物一般用8 头加样器，套吸嘴时要注意是否有套紧，否则加样量会减少，引起加样不准确，加液时要加在ELISA 板孔的底部，避免溅出、产生气泡等。特别是加酶试剂，操作时不能溅到微孔板的外面，酶试剂要加在微孔板的中央，否则很容易使结果产生假阳性。加酶试剂是整个ELISA 试验中最重要的步骤，这个步骤做好了，这个试验的质量就得到了保证。加底物时，各种试剂盒的显色剂不能混用。孵育时间和温度严格按照操作说明书规定， 温育的条件对结果有一定影响[3]，加样完毕后封上封纸防止标本或反应液蒸发在孔壁上。洗板的次数可能对结果有影响[4-5]，要严格按照说明书规定的次数使用专用洗液。 洗板前应先将洗板机管道清洗干净将洗液注满管道， 保证洗液充满各孔，洗板结束后，应在脱水机上脱去反应板残留的少量洗液。显色是ELISA 反应中最重要的一个步骤，关系着试验的成败。 孵育时要按照操作规程掌握好孵育的时间和温度[6]。在加显色剂时不能加到孔外，应用洗水纸吸干；加终止液时不能产生气泡；为了提高分析样本的准确度，应用酶标仪判读检测结果，先打开酶标仪电源预热15 min， 比色前把酶标板底部用吸水纸吸干，然后将板放在酶标仪架上。

3 重视培养学生的质量控制

每批标本都要做空白对照阴性对照、阳性对照和质控，保证操作的质量。

4 生物安全教育

ELISA 检测的对象多为感染性的标本，因此，对实习生的生物安全教育很重要[7]，一些标本，如梅毒、艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎试剂盒的阳性对照有一定的危害，需妥善处理[8]；如果怀疑是艾滋病的标本，要用有效氯为2 000 mg/L 的消毒液浸泡30 min 后清洁处理。

总之，ELISA 是检验医学实习中最基本的检验技术操作，操作过程中有许多细致的步骤和注意事项，要严格按照操作规程认真仔细地进行。避免假阳性和假阴性结果的出现，保证检测结果真实可靠。

[1] 李蓉. 论影响酶联免疫吸附试验检测结果的常见因素及控制方法[J].内蒙古中医药，2011，30（20）：120-121.

[2] 孙鑫，陈彦，张继瑜，等. 不同程度溶血对ELISA 法检测血清HBVM的影响[J]. 世界感染杂志，2004，4（2）：174-176.

[3] 徐锡霞，邓巍. 温育条件对ELISA 定性测定HBsAg 结果的影响[J]. 实用肝病杂志，2006，1（1）：16-18.

[4] 马兰，吴涛，朴桂花，等. ELISA 检测HBSAG 洗板方法的探讨[J]. 中国误诊学杂志，2011，11（35）：8596.

[5] 刘祖勇. 增加洗板次数HBsAg ELISA 检测影响[J]. 中国输血杂志，2006，19（2）：135-136.

[6] 叶炼，赵政，王芳，等. 酶联免疫试验两步法检测乙型肝炎病毒表面抗原的影响因素分析[J]. 检验医学与临床，2013，10（19）：2546-2547.

[7] 王伟娟，杨焦峰，郑辉，等.检验科实习生生物安全防护调查及对策[J].检验医学与临床，2014，11（21）：3082-3083.

[8] 陈利民，张凡非，刘玲，等. 浅析病原微生物试验室生物安全管理对策[J]. 中国药物与临床，2014，10（14）：1457-1458.