基于电化学基因传感器的冬虫夏草及其伪品北虫草的鉴别*

基于电化学基因传感器的冬虫夏草及其伪品北虫草的鉴别*

★丁妍华*谢一辉张秀秀王琼樊浩*

(江西中医药大学药学院南昌 330004)

摘要：目的：构建一种能够灵敏鉴别中药冬虫夏草及其伪品北虫草的电化学基因传感器。方法：β-环糊精修饰的具有特异性分子识别特性的金纳米颗粒(Au-CDS)被用作电化学信号提供者和主体分子。用3’端标有dabcyl，5’端标有氨基的发卡探针DNA进行电极修饰，冬虫夏草的DNA片段可以和该探针DNA形成双螺旋结构，从而将目标杂交事件转换为Au-CDS提供的电流信号，该信号变化可通过循环伏安法灵敏检测，目标DNA特异性基因位点的微小差异可产生显著的电流响应差异。结果：可灵敏检测2.6×10-12M的目标DNA。结论：该传感器为冬虫夏草的快速鉴别提供了一种新方法和工具。

关键词：冬虫夏草基因鉴别；电化学传感器；双标记DNA探针；主客体识别

为了控制中药质量、保证临床用药的安全有效，中药鉴定成为中医药研究的重要工作。传统的中药材鉴别主要依据形态学特征和理化性质，但物种的差异归根结底是由于它们的DNA序列不同，所以最具有决定意义的是分子生物学层次的鉴定。目前应用于药用植物鉴别的分子生物学方法主要有：限制性片段长度多态性(RFLP) 、随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机引物PCR(AP-PCR)、DNA指纹技术(DAF)和生物芯片等技术[1]，也取得了一定成果：对雷公藤的ITS and 5S rDNA 序列进行分析，为雷公藤的分子鉴定提供了依据[2]。采用PCR直接测序技术测定五鹤续断的18S rRNA基因核苷酸序列及大青叶核基因ITS2区,为这两种中药材的分子鉴定提供了依据[3-4]。通过对当归及其混伪品中药材rDNA ITS序列的分析，发现rDNA ITS序列特征可作为当归及其混伪品药材鉴别的有效分子标记[5]。电化学DNA传感器因其具有不破坏测试样品、不受溶液颜色影响、灵敏、快速、简便、便于微型化等优点,已逐渐成为分子生物学研究中对DNA 序列进行直接检测的方法之一[6]。但是目前来说，电化学DNA传感技术应用于中药材基因鉴定的研究是非常少的[7]。针对当今中药市场假冒伪劣的冬虫夏草混淆品的情况，构建一种操作简单，灵敏，快速，便携的基因鉴别电化学传感器是一项很有意义的研究。

该课题组研究了一种基于4-4-二甲氨基苯基偶氮苯甲酸(dabcyl)与环糊精主客体分子识别作用电化学检测均相溶液发生的DNA杂交的新方法[8-9]。环糊精(CDs)是一种内部有疏水性空腔而外部是亲水的环形结构的低聚糖。这种特殊结构赋予环糊精及其衍生物特异的识别和包裹客体分子的能力。作者合成了一种表面固定了β-环糊精金纳米颗粒(Au-CDS)，用作电化学信号提供者和具有特异性分子识别特性的主客体识别者。3’端标有dabcyl，5’端标有巯基的发卡DNA被用作探针DNA，并预先通过金硫键自组装在金电极表面，如图1所示，在传感器的初始状态，由于探针DNA茎环结构的空间位阻效应，dabcyl难以被溶液中Au-CDS。在目标DNA检测时，探针DNA发生构型转变，迫使dabcyl远离电极表面，从而可被Au-CDS通过主客体识别捕获，即可实现将目标杂交事件转换为Au-CDS提供的电流信号。

1 实验部分

1.1 实验试剂 β-CDs购自Sigma Aldrich化学集团；dabcyl标记的发卡DNA探针、三碱基错配DNA以及完全不互补DNA均购自上海Sangon生物技术公司，并通过HPLC纯化。冬虫夏草以及北虫草DNA是从中药材中提取并鉴定。具体基因序列如下：dabcyl标记的冬虫夏草基因发卡探针DNA(Probe DNA)：5’-SH- CCACGCATTTCGGGGCGTGG-DABCYL-3’；三碱基错配序列(购买)：5’- GCCCCGTTTTG -3’；完全不互补序列(购买)：5’ -GCATTTCGGGG-3’；目标DNA(冬虫夏草基因片段)： 5’-GCCCCGAAATG-3’；单碱基错配DNA(北虫草同等位置的基因片段)： 5’- CCCCCGAAATG -3’；其余化学试剂均购自中国上海鼎国生物科技公司；所有溶液均是由Millipore Milli-Q system超纯水配制；所用试剂若无特殊说明，均为分析纯。

1.2 仪器 原子力显微镜(SEM)(瑞士 Nanosurf EasyScan)；电化学分析仪(美国CHI 660)；电化学反应池(5mL)；电化学系统(铂丝作对电极；Ag/AgCl(饱和KCl溶液)电极作参比电极；探针DNA修饰的玻碳电极(直径3 mm)作为工作电极)。

参考文献1.3 巯基环糊精(SH-β-CD)的制备 SH-β-CD合成并原有基础上有所改进[10]。首先，取5.20g(20 mmol)三苯基膦 和5.05g(20 mmol)碘液加入20mL DMF溶液中，在氮气保护下，边搅拌边加入1.10 g(1.0 mmol)β-CD，混合后的溶液在80℃条件下搅拌15h，然后浓缩到一半的体积，加入甲醇钠的甲醇溶液(3 M, 8.0 mL)调pH9-10，并冷却。将上述溶液置于室温下30min以破坏反应过程中生成的酯，然后倒入100mL的冰甲醇溶液中，随后再倒入500mL的冰水，生成沉淀。过滤出沉淀，并用水和甲醇洗涤，干燥，得到白色粉末状SH-β-CD(1.56g, 0.82mmol)。将上述实验得到的SH-β-CD(1.56g, 0.82mmol)溶于16mL DMF中，再加入0.48g(6.4mmol)硫脲，在氮气保护下，加热到70℃。反应19h之后，减压使DMF下变成黄色油状物并溶于90mL水中，剩余的反应物中加入0.42g(1.05mmol)氢氧化钠,在氮气保护下低温回流1小时，得到的悬浮物用KHSO4酸化，滤出沉淀物，用蒸馏水洗净，烘干。为了除去残留的DMF，将得到的产品溶于水形成悬浊液，再加入极少量的KOH形成一个澄清的溶液，加入KHSO4的水溶液再沉淀。沉滤出沉淀物，真空干燥，得到黄白色粉末状的SH-β-CD(0.85g，0.83mmol)，熔点134-136℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ5.92 (d, J = 6.0 Hz, 7 H), 5.82 (s, 7 H), 4.93 (s, 7 H), 3.68 (t, J = 6 Hz, 7 H), 3.61 (t, J = 7.5 Hz, 7 H), 3.19 (br d, J = 15 Hz, 7 H), 2.77-2.74 (m, 7 H), 2.13(t, J = 6.0 Hz, 7 H). MS (ESI) m/z [M + Na]+: 1269.1920。 图7目标DNA检测的标准曲线浓度范围

1.4 巯基环糊精功能化的金纳颗粒(Au-CDs)的制备 巯基环糊精功能化的金纳米参照文献合成[11]。取0.6mM的 HAuCl4的(H2O:DMSO=1∶4)溶液20mL，加入16mL含有8.0mg SH-β-CD 和 60.4mg NaBH4的DMSO溶液，混合均匀，在室温下持续搅拌24h，之后加入32mL CH3CN，离心，弃去上清液，得到的沉淀分别用50mL CH3CN:DMSO (1∶1, v/v)和50mL无水乙醇洗涤，离心，弃去上清液。得到的样品真空干燥后置于60℃环境下过夜，之后室温保存。

1.5 羧基功能化的碳纳米管改性玻碳电极的制备 将玻碳电极(直径3mm)在砂纸和涂有Al2O3(粒径在0.05 m 和 0.3 m之间)白浆的麂皮上仔细打磨干净，随后置于蒸馏水中超声清洗。在超声搅拌情况下，将1 mg羧基功能化的碳纳米管溶解到1mL的蒸馏水中，溶液呈黑色。取5μL上述溶液，滴加到玻碳电极表面，置于红外灯下干燥并形成黑色均匀的薄膜，即得到MCNTs/GCE。

1.6 Probe DNA修饰电极的制备 取5 μL 100 mg /mL EDC溶液滴加到 MCNTs/GCE电极表面，随后立即再取5 μL 100 mg /mL NHS溶液滴加到电极表面。在湿度为100%环境下，将电极浸入到probe DNA溶液中反应2h。反应完全后，用去离子水冲洗电极表面，得到Probe DNA/MCNTs/GCE待用。

1.7 DNA电化学检测 DNA检测过程：首先将制备好的Probe DNA/MCNTs/GCE电极浸入含有target DNA和Au-CDs的溶液中，37℃反应1h，目标DNA与探针DNA形成双链螺旋结构，迫使dabcyl远离电极表面，如图1所示，从而可以被Au-CDS通过主客体识别捕获进入到纳米颗粒表面的β-CD空腔中，这样，Au-CDs即被带到电极表面，将反应后的电极取出，去离子水充分洗涤后，再在1mL0.1M HCl溶液中在+1.25V(vs. Ag/AgCl)预处理120s使金纳米颗粒氧化成AuCl4-,随后在50mV脉冲幅度和50ms脉冲宽度下从+0.7V到0.0V扫DPV。在此电位扫描过程中，约在0.4V得到还原AuCl4-的良好电化学信号，可用于目标DNA的特异性识别和定量分析。

图1　基于主客体识别技术构建的DNA电化学传感器

2 结果和讨论

2.1 杂交条件优化 杂交体系的pH及杂交温度对Probe DNA与目标DNA交形成双螺旋DNA结构有一定影响。因此，我们做了一系列的实验来优化杂交体系。我们研究了pH6.5到pH8.0间杂交体系的酸度对杂交反应的影响，不同pH值环境下的DPV信号有着较为显著的差异，如图2所示， pH在7.2附近，得到最大的DPV信号，故选pH7.2为最适pH。如图3所示。杂交温度对双螺旋DNA的形成同样有影响，故而我们探索了25到40℃间不同温度下0.1 M磷酸缓冲液中发生的杂交反应。DPV信号在35℃到40℃间出现平台(图3)，因此选择37℃作为实验杂交温度。

2.2 基于主客体识别的冬虫夏草基因电化学DNA传感研究 为了研究基于主客体识别的电化学DNA传感器的构建技术，我们进行了对比实验。首先，将Probe/MCNTs/GCE浸入含有只含有Au-CDs的溶液空白中，在37℃条件下孵育1h,如图4所示，只得到一个相对小的电流信号(a)。相反地，当Probe/MCNTs/GCE浸泡到包含target DNA 和Au-CDS的溶液中1h，我们能得到一个显著的电化学信号(图4)。上述实验说明，当Probe DNA 和 Target DNA杂交之后，Probe DNA末端的dabcyl被Au-CDS上的环糊精捕获，进而产生一个显著的电化学信号。

图2　不同pH下目标DNA的DPV信号

图3　在不同的杂交温度下，检测8.4×10-7

图4　空白PBS溶液与含2.8×10-10

2.3 基于主客体识别的电化学DNA传感对冬虫夏草及其伪品北虫草的鉴别研究 该研究对电化学DNA传感器的特异性进行了一系列试验。使用传感器对一系列不同的DNA进行了检测，所得到的电流信号如图所示，传感器与完全非互补的DNA作用得到的电化学信号(图5,a)与非特异性吸附所产生的信号(图5,b)相近，同样三碱基错配的DNA也不能产生明显的电信号(图5,c)变化。这说明Probe DNA在未杂交时，保持茎环结构，有效阻碍了dabcyl被Au-CDs上的环糊精捕获，在电极表面只有很小的非特异性吸附同时仅仅产生很小的DPV信号。当北虫草基因序列杂交，得到较小的电化学信号(图5,d)仅为冬虫夏草基因(图5,e)的三分之一左右,冬虫夏草和北虫草同等位置的DNA片段只有一个碱基不同，而得到的电化学信却相差很大。显著的信号差异表明探针 DNA能很好特异性识别目冬虫夏草与北虫草基因的SNP，该研究构造的电化学DNA传感器能够有效的区分冬虫夏草与北虫草基因的SNP，从而快速鉴别冬虫夏草和北虫草。

图5　传感器检测不同目标DNA得到的DPV信号：(a)完全

该研究表明，不同浓度目标DNA，得到的作为杂交信号的AuCl4-的还原峰电流不同。如图6所示，随互补序列DNA浓度的连续增大，得到的DPV信号也相应增强。如图7所示，DPV信号与目标DNA浓度在3.4×10-12到3.4×10-9M浓度范围内呈对数关系，得到相关系数为0.9876的校准方程式y=1.109logx+1.3(x是DNA的浓度,单位：pM, y是峰电流)，检测限为2.6×10-12M。

3 结论

该研究构建的电化学基因传感器，能够对2.6×10-12M的冬虫夏草DNA片段具有较灵敏的电信号响应，解决了微量药材的鉴定难题，为今后中药材鉴定提供了新思路。基于分子识别技术的电化学DNA传感器能够特异性的识别基因片段差异极小的冬虫夏草和北虫草，保证了对冬虫夏草高效精准的鉴定。电化学基因传感器本身具有的不破坏测试样品、不受溶液颜色影响、灵敏、快速、便于微型化等优点都预示着它在中药鉴定中的广阔前景。

图6　Probe DNA/MCNTs/GCE分别不同浓度

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收稿日期：(2015-04-08)编辑：曾文雪

中图分类号：R282.5

文献标识码：A

通信作者：樊浩 (1980一),男，副教授。研究方向：中药鉴定和生物传感器。E-mail:fanhao11@yahoo.com.cn。

基金项目：第一作者：丁妍华(1990—)，女，在读硕士研究生。E-mail: dyh1107@126.com。