卷丹鳞茎多酚组成及其抗氧化活性研究

焦灏琳，张延龙,牛立新

(西北农林科技大学 a 林学院，b 园艺学院，陕西 杨凌712100)

卷丹鳞茎多酚组成及其抗氧化活性研究

焦灏琳a，张延龙a,牛立新b

(西北农林科技大学 a 林学院，b 园艺学院，陕西 杨凌712100)

【目的】 研究卷丹鳞茎提取物的多酚物质组成及其抗氧化活性，为卷丹的进一步开发提供理论参考。【方法】 以野生卷丹鳞茎为材料，用Folin-Ciocalteau法测定卷丹鳞茎多酚提取物的总酚含量，用HPLC法测定多酚组分，并测定了卷丹鳞茎提取物对ABTS、DPPH和羟自由基的清除能力。【结果】 卷丹鳞茎提取物总酚含量为48.78 mg/g；HPLC共鉴定出10种酚类成分，其中表儿茶素、芦丁和二氢槲皮素为主要成分，其含量分别为4.58,3.10和 1.45 mg/g；多酚提取物对ABTS·、DPPH·和OH·3种自由基均表现出较强的清除能力，且清除作用与多酚质量浓度呈显著性正相关，R2分别为0.964，0.992和0.838。【结论】 卷丹鳞茎提取物具有较强的抗氧化能力，可作为一种天然的植物抗氧化剂来源。

卷丹；抗氧化活性；酚类物质；HPLC

卷丹(LiliumlancifoliumThunb)，百合科百合属(Lilium)多年生草本植物，在我国分布极广，主产于长江流域。卷丹不仅具有较高的观赏价值，而且其鳞茎部位药食兼用，具有养阴润肺、清心安神的功效[1]，是我国药典收录的3种药用百合之一，也是百合药材的主要来源。现代研究表明，卷丹鳞茎中含有多糖、甾体皂苷、生物碱、黄酮、酚酸甘油酯等多种生物活性物质[2]；药理学分析表明，卷丹鳞茎的醇提取物具有抗氧化、抗真菌[3]与抗炎[4]的作用。植物酚类化合物大多具有抗氧化能力，而抗氧化能力与其抗肿瘤、抗菌、抗炎等生物活性直接相关[5]。目前，对卷丹鳞茎生物活性物质的研究主要集中在甾体皂苷上，而对其酚类物质组成和抗氧化能力的研究鲜有报道。因此，本研究以野生卷丹鳞茎为试验材料，分析其鳞茎提取物的多酚含量和具体组分,以及对多种自由基的抑制和清除能力，以期为卷丹的进一步开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

卷丹百合种球于2012-08采自陕西省汉中市汉台区天台山。将新鲜百合鳞茎去泥洗净，真空冷冻干燥，粉碎，过0.15 mm筛，密封备用。

所用试剂：ABTS、DPPH、没食子酸、矢车菊素芸香糖苷、飞燕草素、木犀草素、儿茶素、绿原酸、根皮苷、柚皮素、表儿茶素、二氢杨梅酮、芦丁、对香豆酸、二氢槲皮素、圣草酚和山奈酚，标准品级(中国上海Sigma公司)；甲醇，色谱级(天津博迪化学试剂公司)；其余试剂为分析纯(西安化学试剂公司)。

所用仪器：LC-2010AHT高效液相色谱仪(日本岛津公司)，LGJ-10真空冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂)，RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，KDC-140HR高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 多酚提取 准确称取百合干粉5.0 g， 加入25 mL甲醇，超声提取20 min(40 ℃、 100 W)，离心10 min(8 000 r/min)后取上清液，重复上述过程3次。合并提取液经真空旋转蒸发，用甲醇定容至25 mL，4 ℃保存。

1.2.2 多酚总量测定 采用Folin-Ciocalteau法[6]测定卷丹鳞茎中的总酚含量，以没食子酸为标准品。用甲醇配制质量浓度为0.5 mg/mL的没食子酸标准品溶液，连续稀释得到没食子酸标准溶液分别为0.5，0.25，0.13，0.06，0.03和0.015 mg/mL。准确吸取各梯度的没食子酸标准品溶液和多酚提取液各0.1 mL于具塞试管中，依次加入7.9 mL蒸馏水和0.5 mL Folin-Ciocalteau试剂，混匀后反应5 min，加入质量分数20% 的Na2CO3溶液1.5 mL，暗处反应2 h后于765 nm处测定吸光值。标准曲线的线性回归方程为y=0.973 0x+0.010 8，R2=0.998 4，多酚含量表示为mg/g。

1.2.3 多酚组分的高效液相色谱(HPLC)检测和含量测定 将制备的多酚提取液经0.22 μm 滤膜过滤，备用，通过与各标准品保留时间的对比进行单体酚物质定性，峰面积定量。

色谱条件：LC-2010AHT高效液相色谱仪，配备自动进样器和光电二级阵列检测器；色谱柱：Hibar C18反相色谱柱 (250 mm×4.0 mm，5 μm)；流动相：A 乙酸水(V(乙酸)∶V(水)=99.6∶0.4)，B乙腈；洗脱程序：0～40 min、5%～40% B，40～45 min、40%～100% B，45～60 min、100% B；柱温：40 ℃；流速：0.5 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：280～360 nm。标准品从固定的质量浓度(1 mg/mL)开始进行连续的稀释以获得标准曲线，多酚单体酚含量单位为mg/g。

1.2.4 多酚的抗氧化活性 (1)对ABTS自由基的清除能力。参照Re等[7]的方法，将卷丹鳞茎多酚提取液用甲醇配制成5个不同质量浓度(1，2，3，4，5 mg/mL)的溶液。ABTS阳离子制备方法为，将7 mmol/L 5 mL ABTS溶液与140 mmol/L 80 μL过硫酸钾溶液暗处反应12 h以上，使用前用甲醇稀释到A734 nm为0.7左右。取0.1 mL 不同质量浓度卷丹鳞茎多酚提取液，加入3.9 mL ABTS·溶液，以相同体积的甲醇代替多酚提取液为空白对照(A0)，反应6 min 后于734 nm处测定吸光值(AS)，计算清除率。

(2)对DPPH自由基的清除能力。参考Brand-Williams等[8]的方法，并略有改动。取0.1 mL不同质量浓度卷丹鳞茎多酚提取液，加入3.9 mL 6.25×10-5mol/L DPPH (加甲醇配制)，充分混匀；以相同体积的甲醇代替多酚提取液为空白对照(A0)，暗处反应30 min后在517 nm 处测定吸光值(AS)，计算清除率。

(3)对羟自由基的清除能力。参照Sroka等[9]的方法，将9 mmol/L FeSO41 mL、体积分数 0.15% H2O245 μL和9 mmol/L水杨酸溶液1 mL依次加入4 mL蒸馏水中，与1 mL不同质量浓度卷丹鳞茎多酚提取液混匀后，于37 ℃水浴30 min，以相同体积的甲醇为空白对照(A0)，在536 nm处测定吸光值(AS)，计算清除率。

1.3 数据统计分析

所有试验数据均重复测定3次，结果表示为“平均值±标准差”。

自由基清除率的计算公式为：清除率=[1-(AS-A0)]×100%；分析清除率(y)与多酚提取物质量浓度(x)之间的关系。通过SPSS 16.0软件对数据进行方差分析，差异显著性水平P<0.05。

2 结果与分析

2.1 卷丹鳞茎中多酚含量及组成

多酚类物质具有2个或多个活泼的酚羟基结构，可通过提供氢原子或电子有效清除自由基，直接参与体内的抗氧化过程[5]。如表1所示，卷丹鳞茎提取物总酚含量为48.78 mg/g。HPLC共鉴定出10种酚类物质，包括2种酚酸(绿原酸、对香豆酸)、2种黄烷醇单体(儿茶素、表儿茶素)、2种黄酮醇(芦丁、山奈酚)、2种黄烷酮醇(二氢杨梅酮、二氢槲皮素)、1种黄烷酮(圣草酚)和1种花青素(矢车菊素芸香糖苷)。这10种多酚单体含量总和为10.69 mg/g，占总酚含量的21.91%,其中表儿茶素(4.58 mg/g)、芦丁(3.10 mg/g)和二氢槲皮素(1.45 mg/g)含量较高，为卷丹鳞茎中主要的酚类物质。

表1 卷丹鳞茎中总酚含量、多酚组分及其含量
Table 1 Content of total phenols and individual phenolic compound from bulbs ofLiliumlancifoliummg/g

2.2 卷丹鳞茎多酚提取物的抗氧化活性

2.2.1 对ABTS自由基的清除能力 ABTS·法是一种快速、简便，广泛应用于日常检测的分光光度分析法。ABTS阳离子自由基是ABTS原液与过硫酸钾黑暗中反应12 h以后产生的，其溶液呈绿色，在734 nm处有最大吸光值。在供氢抗氧化剂加入后，ABTS中单电子配对褪色。由图1可知，卷丹鳞茎多酚提取物对ABTS·的清除作用与多酚质量浓度呈明显的量效关系，ABTS·清除率(y)与多酚质量浓度(x)的线性方程为y=13.68x-6.356，R2值为0.964。

2.2.2 对DPPH自由基的清除能力 DPPH自由基是一种人工合成的稳定自由基，其醇溶液呈紫色，在517 nm处有较强吸收，与样品提供的氢原子反应后吸光值变小。因此，测定样品的DPPH·清除率可简便准确地评价其抗氧化能力。图2表明，卷丹鳞茎多酚提取物对DPPH·的清除作用明显，清除率随多酚提取物质量浓度增加而加大，DPPH·清除率(y)与多酚质量浓度(x)的线性方程为y=17.24x-15.72，R2值为0.992。

2.2.3 对羟自由基的清除能力 羟自由基是生物体内非常活跃的自由基，对机体危害很大，可穿过细胞膜与绝大多数生物大分子如蛋白质、脂质、DNA等反应，造成细胞死亡和组织损伤[12]。本试验用EDTA二价铁盐与双氧水生成羟自由基，水杨酸作为OH·的捕捉剂，通过比色法定量测定OH·的产率及卷丹鳞茎对OH·的清除作用。结果(图3)表明，卷丹鳞茎多酚提取物对OH·的清除率随多酚提取物质量浓度增加明显增大，OH·清除率(y)与多酚质量浓度(x)的线性方程为y=12.13x+2.720，R2值为0.838。

3 讨 论

多酚物质具有2个或多个酚羟基结构，易溶于有机溶剂，甲醇是应用最广泛的多酚提取溶剂。Cai等[10]用相同的Folin-Ciocalteau法测定了112种中国传统中草药药用部位的总酚含量。本研究中卷丹鳞茎的多酚含量(48.78 mg/g)高于文献[10]中的95种中草药，仅低于五倍子、石榴皮等17种中草药。陆英等[11]以百合(Liliumbrownii)鳞茎为材料，用甲醇回流提取，并利用大孔吸附树脂对提取物进行纯化后测得其多酚含量为6.68%，高于本研究中卷丹的多酚含量(4.88%)，其原因主要与纯化效果有关。

本研究通过HPLC从卷丹鳞茎中鉴定出10种酚类物质，其中表儿茶素、芦丁和二氢槲皮素是主要的酚类物质。表儿茶素已被证明具有强的抗氧化性，能够清除体内羟自由基、超氧化物和过氧化氢自由基，具有降低血脂的作用[12]。芦丁可有效抑制细胞内的脂质过氧化过程，具有保护组织黏膜和增强血管活性的作用[13]。Francis等[14]报道，麝香百合花瓣的有效药用成分主要是山奈酚和槲皮素，其能够有效清除自由基并抑制环氧合酶的表达，从而减轻人体炎症，这2种物质在卷丹鳞茎中均被检测到。但本试验仅对卷丹鳞茎的多酚粗提物及其体外抗氧化活性进行了初步研究，对于多酚单体的体内抗氧化活性还有待进一步研究。

靳磊等[15]研究了宜昌百合3个生态型的鳞茎多酚提取物对DPPH·和OH·的清除能力，在相同质量浓度(2 mg/mL)下，卷丹鳞茎多酚提取物对DPPH·的清除能力(41.75%)高于西乡县宜昌百合(40.04%)、立节镇宜昌百合(32.29%)，但是低于留坝县宜昌百合(44.34%)[15]；而对OH·的清除率均高于3种宜昌百合。这表明不同百合品种鳞茎多酚提取物抗氧化能力存在差异，卷丹鳞茎多酚提取物对OH·的清除能力更强。周中流等[16]比较了卷丹鳞茎乙醇提取物及不同极性部位的抗氧化活性，发现卷丹抗氧化活性部位主要集中在乙酸乙酯和正丁醇提取部位。

4 结 论

卷丹鳞茎富含多酚物质， HPLC共检测出10种酚类物质，其中表儿茶素、芦丁和二氢槲皮素是其主要成分。多酚提取物对ABTS·、DPPH·和OH· 3种自由基具有明显的清除能力，表现出较强的抗氧化活性。因此将卷丹鳞茎作为功能性食品和天然抗氧化剂，有较好的开发和应用前景。

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Phenolic composition and antioxidant activity of polyphenols from bulbs ofLiliumlancifoliumThunb

JIAO Hao-lina,ZHANG Yan-longa,NIU Li-xinb

(aCollegeofForestry,bCollegeofHorticulture,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 Phenolic compounds extracted from bulbs ofLiliumlancifoliumThunb were investigated and their antioxidant activity was evaluated to provide basis for further development and application.【Method】 ABTS radical-scavenging,DPPH radical-scavenging and hydroxyl radical-scavenging assay were carried out to evaluate the antioxidant activities,total phenolic content was measured using the Folin-Ciocalteau method and phenolic composition was identified by HPLC.【Result】 The total phenolic content fromLiliumlancifoliumbulbs was 48.78 mg/g.A total of ten phenolic compounds were identified and quantified,in which (-)-epicatechin,rutin and dihydroquercetin were the major compounds with contents of 4.58,3.10,and 1.45 mg/g,respectively.The bulb extracts exhibited strong radical scavenging capacities to ABTS·,DPPH·,and OH· radical,and the activities positively correlated with mass concentration of phenolic compounds withR2value of 0.964,0.992 and 0.838,respectively.【Conclusion】 The bulb extracts ofLiliumlancifoliumThunb had significant antioxidant capacity and could be a potential nature source of antioxidants.

LiliumlancifoliumThunb;antioxidant activity;phenols;HPLC

2014-01-02

陕西省林业厅项目(陕林计字[2011]70号)

焦灏琳(1989-)，女，陕西西安人，硕士，主要从事百合鳞茎抗氧化活性研究。E-mail:njaujiaohaolin@163.com

张延龙(1964-)，女，陕西延安人，教授，博士生导师，主要从事园林植物资源与育种研究。 E-mail:zhangyanlong@nwsuaf.edu.cn

时间:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.013

S682.2+65

A

1671-9387(2015)07-0150-05

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.013.html