三色堇花色素合成途径中部分结构基因的克隆及生物信息学分析

龚 胜,孙海燕,张 珂,曾 媛,李 婧,王 健,李新国

(海南大学 园艺园林学院，热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室，海南 海口 570228)

三色堇花色素合成途径中部分结构基因的克隆及生物信息学分析

龚 胜,孙海燕,张 珂,曾 媛,李 婧,王 健,李新国

(海南大学 园艺园林学院，热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室，海南 海口 570228)

【目的】 对三色堇花色素合成的3个结构基因VwCHS、VwCHI和VwF3H进行克隆以及生物信息学分析。【方法】 利用RACE/PCR技术克隆得到VwCHS、VwCHI和VwF3H基因的全长序列，并通过在线分析软件对其生物信息学进行分析。【结果】 获得VwCHS、VwCHI和VwF3H的cDNA全长分别是1 481，975和1 361 bp；经多重序列比对发现这3个基因编码的氨基酸与其他植物相关氨基酸一致性较高，主要集中在62%～90%，并且在CHS氨基酸序列中有4个催化活性位点(Cys171、Phe222、His310、Asn343)，在CHI氨基酸序列中有4个催化活性位点(Thr50、Tyr108、Asn115、Ser192)，在VwF3H氨基酸序列中有5个催化活性位点(Asp218、His253、Arg215、Arg284、Ser286)；VwCHS、VwCHI、VwF3H的蛋白质分子量分别为9.91，5.37，4.1 ku，等电点为5.02，5.16，5.44；二级结构预测发现，VwCHS和VwCHI二级结构主要是α螺旋，分别占43.39%和41.89%，VwF3H的蛋白质二级结构主要是无规则卷曲，占42.30%；聚类分析发现VwCHS、VwCHI和VwF3H分别归属于各自的聚类簇。【结论】 VwCHS、VwCHI和VwF3H是不存在信号肽的非跨膜蛋白。

三色堇；查尔酮合成酶(CHS)；查尔酮异构酶(CHI)；黄烷酮-3-羟化酶(F3H)；生物信息学；基因克隆

花色是植物最具有吸引力的观赏性状之一，它赋予了植物无穷的魅力。花色素是使植物呈现万千色彩的内在原因之一，其分布于植物的细胞液泡中，能使花呈现出橙色、红色、紫色或蓝色等。花色素的形成与分布主要受两大类型基因的控制：一类是与花色素形成相关的催化酶基因，即结构基因[1]；另一类是调控催化酶基因表达的调控基因[2-4]。与花色素形成相关的催化酶基因是花色素生物合成的基础，20世纪80年代末至90年代初，植物花色素和类黄酮物质代谢途径已研究的较为清楚[5]。花色素的生物合成途径大致包括3个阶段：第1阶段是苯丙氨酸以苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸羟化酶(C4H)和CoA连接酶(4CL)为催化剂反应生成4-香豆酰CoA，该过程主要受PAL基因调控；第2阶段是4-香豆酰CoA在查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)、黄烷酮-3-羟化酶(flavanone-3-hydroxylase,F3H)的催化作用下形成二氢黄酮醇；第3阶段是花色素的形成，该过程依次需要类黄酮-3′-羟化酶(flavonoid-3′-hydroxylase，F3′H)、类黄酮-3′,5′-羟化酶(flavonoid-3′,5′-hydroxylase，F3′5′H)、二羟基黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR)、花青素合成酶(Anthocyanidin synthase,ANS)等为催化剂[6-7]。在花青素生物合成途径中，第2阶段的催化酶CHS、CHI和F3H为形成有色化合物所必需。

植物的花斑是花色素在某个特定区域的积累，它直接影响植物的观赏价值，而了解花斑形成机理对于观赏植物的花色育种有着十分重要的意义。以色斑区域色素合成催化酶基因的特异性表达作为研究花斑机理的着手点无疑为花斑机理研究提供了一个新的方向。三色堇(Viola×wittrockiana)是堇菜科堇菜属的一二年生花卉，其花色艳丽，花期长，为冬季花坛、花境及盆花等常用花卉，近年来在我国得到了大量园林应用。三色堇花瓣色斑区域较大，色斑区与非色斑区界线比较明显，它的花斑遗传规律和花色组成研究基础较好，是研究花斑机理的理想模式植物[8]。目前关于花色素生物合成途径中催化酶基因CHS、CHI和F3H的研究很多，如将反义CHS基因转入矮牵牛中，从而抑制其花色素的合成，进而获得白花植株[9]；利用RNAi技术抑制烟草(Nicotianatabacum)内源基因CHI转录，使其花瓣颜色发生了改变[10]；以反义抑制法抑制F3H基因表达，获得的转基因植株花色发生了不同程度的改变[11]。但是在三色堇中关于CHS、CHI和F3H基因的研究却未见报道。

生物信息学是包含了生物信息的获取、处理、储存、分析和解释等在内所有方面的一门交叉学科，它以核酸和蛋白质数据库为研究对象，利用计算机、数学等手段对原始数据进行处理、储存、分析和解释，目的在于了解和阐明大量生物学数据所包含的生物学意义[12]。生物信息学的诞生为更快捷地对已知的核酸和蛋白质序列进行比对、分析、建立计算模型以及对蛋白质组结构与功能进行预测奠定了基础[13]。

本研究利用简并引物扩增保守区域后使用RACE技术扩增3′末端及5′末端，进而获得三色堇花色素合成相关的3个结构基因的全长序列，即VwCHS、VwCHI和VwF3H，再结合生物信息学的方法对这3个结构基因的核酸序列和编码氨基酸序列进行结构和功能的分析、预测，以期为三色堇花斑形成机理的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验材料为花色黄底黑斑三色堇(Viola×wittrockiana)‘宾哥’系列，种植于海南大学园艺园林学院基地。将花瓣采摘后迅速置入液氮中速冻，然后置于-70 ℃冰箱保存备用。

1.2 方 法

三色堇花瓣总RNA的提取采用改良Trizol法[14]。提取完成后的总RNA用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.1 结构基因VwCHS、VwCHI、VwF3H的扩增 根据其他植物相关氨基酸序列获得保守区域后，设计简并引物(表1)。以三色堇总RNA为模板，参照TransScriptTMⅡ One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (TransGen，Beijing)说明书进行cDNA第一链合成，并以cDNA第一链为反应模板扩增3个结构基因的保守区域。PCR反应体系为：3 μL 第一链 cDNA,4 μL each primer (10 μmol/L),5 μL 10×PCR buffer, 4 μL 25 mmol/L MgCl2,4 μL 2.5 mmol/L dNTP Mixture,0.8 μL ExTaq(5 U/μL,Takara,China)和25.2 μL ddH2O。PCR扩增循环参数为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s, 52～57 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，40个循环；72 ℃ 10 min。

利用保守区域序列设计3′RACE和5′RACE扩增的特异性引物(表2)。以三色堇总RNA为模板，参照SMARTTMrace cDNA amplification kit (Clontech,Shanghai)说明书进行3′RACE和5′RACE扩增。获得全长序列后，以其开放阅读框设计全长扩增特异性引物(表3)，进行cDNA全长扩增。

1.2.2 扩增片段的克隆及生物信息学分析 利用1.6%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行纯化，并用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(中科瑞泰)回收特异性条带，再连接pMD18-T Simple vector (Takara,Shanghai),转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落摇菌培养，最后利用M13引物进行PCR扩增,检测连接状况。PCR扩增循环参数为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。将结果为阳性的菌液送往上海生工生物技术有限公司进行测序。

获得序列后，利用NCBI的BLAST软件分析比对序列，验证所得序列是否为目的基因序列；利用OFR Finder在线分析软件分析开放阅读框；利用DNAMAN 6.0或ClustalW 2软件将其与其他物种同源序列进行多重序列比对和系统进化分析；使用Expasy和TMHMM Server v.2.0相关在线分析软件，对编码蛋白的结构特点和基本性质进行综合预测分析。

2 结果与分析

2.1 三色堇花瓣总RNA的提取

经改良Trizol法提取的三色堇花瓣总RNA利用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，结果如图1所示，RNA条带清晰，28S与18S条带亮度接近2∶1，说明总RNA完整性好，点样孔无残留，表明纯度高，可以用于后续试验。

图1 三色堇花瓣总RNA电泳结果
M.DL2000 Marker;1～2.总RNA
Fig.1 Electrophoresis for total RNA of petals in pansy
M.DL2000 Marker;1-2.Total RNA

2.2 三色堇花色素合成中3个结构基因的扩增与克隆

首先，通过RT-PCR技术，从三色堇花瓣中扩增得到3个结构基因的部分片段，经BLAST比对后,分别获得CHS(432 bp)、CHI(438 bp)和F3H(461 bp)基因的保守区域(图2)。其次，利用RACE技术，从三色堇花瓣中扩增得到CHS(544 bp)、CHI(470 bp)和F3H(521 bp)基因的3′末端序列(图3)，以及CHS(656 bp)、CHI(227 bp)和F3H(474 bp)基因的5′末端序列(图4)。最后，将扩增得到的3个结构基因的中间片段、3′末端cDNA序列及5′末端cDNA序列利用DNAMAN 6.0软件拼接后，分别获得CHS、CHI、F3H基因的cDNA全长序列，用全长引物进行全长扩增得到CHS(1 481 bp)、CHI(975 bp)、F3H(1 361 bp)(图5)。

图4CHS、CHI、F3H基因5′RACE电泳结果
M.DL2000 Marker;1.CHS;2.CHI;3.F3H
Fig.4 Electrophoretogram for 5′RACE ofCHS,CHIandF3H

图5CHS、CHI、F3H基因全长扩增电泳结果
M.DL2000 Marker;1.CHS;2.CHI;3.F3H
Fig.5 Electrophoretogram for full-length cDNA ofCHS，CHIandF3H

2.3 三色堇花色素合成中3个结构基因的生物信息学分析

经分离获得3个三色堇花色素合成相关的结构基因，即VwCHS(GenBank登录号为KJ463620)、VwCHI(GenBank登录号为KJ463619)、VwF3H(GenBank登录号为KJ463622)。

2.3.1VwCHS、VwCHI和VwF3H基因的核苷酸序列分析 利用BLAST在线分析软件，将三色堇VwCHS、VwCHI和VwF3H基因的核苷酸序列进行同源性分析，发现这3个基因与其他植物相关基因的核苷酸序列相似性均超过69%。而ORF Finder在线分析软件分析得到VwCHS、VwCHI和VwF3H基因的开放阅读框的长度依次是1 212 bp(77-1 288)、651 bp(45-695)和1 098bp(35-1 132)，并分别编码403，216和365个氨基酸。

2.3.2 VwCHS、VwCHI和VwF3H蛋白质分析 (1)蛋白质一级结构分析。将VwCHS、VwCHI和VwF3H编码的氨基酸序列进行多重序列比对，发现这3个基因编码的氨基酸与其他植物相关氨基酸的一致性较高，主要集中在62%～90%(表4)。

三色堇CHS基因编码的氨基酸序列具有CHS发挥作用所必需的高度保守的催化活性位点Cys171、Phe222、His310和Asn343，其中Cys是香豆酰辅酶A的结合位点，并且还具有CHS特别保守的信号序列GFGPG，此外，在三色堇CHS基因编码的氨基酸序列的163-179氨基酸(RLMMYQQGCFAGGTVLR)为查尔酮合成酶的活性位点(图6)。在三色堇CHI基因编码的氨基酸序列中，Thr50、Tyr108、Asn115和Ser192为CHI必需的活性位点，而其中Thr能催化黄酮醇底物中的酮基极性化(图7-A)。在F3H氨基酸序列中，氨基酸残基Asp218和His253是与铁离子结合位点，而Arg215、Arg284和Ser286位点与2-酮戊二酸结合(RXS基序)，这些位点在不同物种的F3H氨基酸序列中都高度保守[15-17](图7-B)。

利用Expasy在线分析软件预测蛋白质的基本理化性质，结果发现VwCHS、VwCHI、VwF3H的蛋白分子量分别为9.91,5.37,4.1 ku，等电点分别为5.02，5.16，5.44。

通过TMHMM Server v.2.0在线分析软件，对VwCHS、VwCHI和VwF3H的蛋白质进行跨膜结构预测，结果表明三色堇中这3个蛋白质整条肽链都位于细胞膜外，说明它们都不存在跨膜结构。

利用signalp 4.1 server 软件分析VwCHS、VwCHI和VwF3H的蛋白质序列，发现它们的mean-s 分值分别为0.111，0.103和0.147，均小于0.5，说明不存在信号肽序列。

(2)蛋白质二级结构预测。通过SOPMA在线软件对蛋白质的二级结构进行预测，获得了三色堇CHS、CHI和F3H蛋白质二级结构的α螺旋、β转角、延伸链以及无规则卷曲的组成(表5)。

2.3.3VwCHS、VwCHI和VwF3H基因编码氨基酸序列的聚类分析 经过聚类分析发现，三色堇花瓣中的VwCHS、VwCHI和VwF3H蛋白都分别归属于各自的聚类簇，并且VwCHS与康乃馨(Dianthuscaryophyllus)的DcCHS蛋白质亲缘关系较近，VwCHI与毛果杨(Populustrichocarpa)的PtCHI蛋白质亲缘关系较近,VwF3H与陆地棉(Gossypiumhirsutum)的GhF3H蛋白质亲缘关系较近(图8)。

3 结论与讨论

CHS是Ⅲ型聚酮合成酶中的一种，是植物类黄酮生物合成途径中第一个关键酶，其在调控类黄酮的生物合成以及类黄酮的成分方面具有决定性作用[18]。在植物中，查尔酮合成酶基因是多基因家族，并且在基因结构上非常保守[19]。在三色堇CHS氨基酸序列与其他植物相关氨基酸的多重序列比对中可以看出，它们的一致性在65%～90%，而且构成三色堇查尔酮合成酶蛋白催化中心的信号序列(G378FGPG)也是保守的[20]。这些都在一定程度上体现了查尔酮合成酶结构上的保守性。查尔酮合成酶基因是类黄酮生物合成途径中下游基因表达的限速因子，它对于花色的形成有着重要的影响，而且查尔酮合成酶基因的表达具有很强的时空特异性[21]。因此，为了制定三色堇花色育种策略，就需要对三色堇查尔酮合成酶基因的表达特异性和分子调控机制进行研究，以期为三色堇的花色育种提供一定的理论依据。

CHI是植物类黄酮生物合成途径中的关键酶之一，也是第一个被认识的黄酮类化合物合成相关酶。CHI基因一般分为两类，即CHIⅠ和CHIⅡ基因，其中CHIⅠ基因编码的蛋白一般为210～240个氨基酸，蛋白间的同源性为50%～80%，CHIⅡ基因的典型结构一般是由4个外显子和3个内含子组成[16]。本研究从三色堇中克隆得到的CHI基因编码的蛋白有216个氨基酸，且其与其他相关蛋白的同源性为62%～77%，因此推断从三色堇中克隆得到的CHI基因可能属于CHIⅠ型基因。对苜蓿CHI的三维结构及突变分析表明，在CHI催化反应中，Thr48、Tyr106、Asn113和Thr190等4个氨基酸残基共同构成了CHI的活性中心，其中Thr48、Tyr106和Asn113在大多数物种中都是保守的，但是Thr190只有在豆科植物中是保守的，在非豆科植物中第190位是丝氨酸(Ser)，但是底物没有变化[22]。而从三色堇中得到的CHI蛋白，其中Thr50、Tyr108、Asn115和Ser192为CHI必需的活性位点，与苜蓿CHI蛋白活性位点相比，三色堇的CHI蛋白质活性位点后移了2个氨基酸位点。由于CHI基因是花色素生物合成途径第2阶段的关键酶之一，因此它在植物中表达量的多少直接影响花色素在植物中的积累。但是目前都是通过间接的手段来验证CHI基因的变化对花色的影响，如通过荧光定量PCR对银杏叶片进行分析发现，查尔酮合成酶活性以及CHI基因的转录水平与叶片中黄酮类物质的积累相关[23]；洋葱查尔酮合成酶的失活使其花色变为金色等[24]，而通过直接改变CHI基因来改变花色的研究还较少。因此，为了更好地了解三色堇花色形成机理，在今后的研究中可通过直接改变CHI基因来探究它的表达调控模式，这不仅可以丰富花色形成机理，还可以为三色堇花色育种提供理论体系支持。

F3H是植物黄酮类化合物代谢途径上的关键酶，属于依赖型2-酮戊二酸的双加氧酶家族，其反应需要2-酮戊二酸、分子氧、铁和抗坏血酸作为辅助因子[25]。本研究结果表明,VwF3H蛋白有2个铁离子结合位点(Asp218、His253)和3个2-酮戊二酸结合位点(Arg215、Arg284、Ser286)。而分析苦荞FtF3H蛋白三维结构得出3个铁离子结合位点(His221、Asp223、His279)和2个2-酮戊二酸结合位点(Arg289、Ser291)，这些位点主要参与和调节蛋白质的代谢、翻译后的修饰和加工，对蛋白质活性非常重要[16]。F3H基因是花色素合成途径第2阶段的第3个关键酶，它的表达情况直接影响花色素在植物中的积累。目前关于三色堇中F3H基因的具体表达调控模式以及酶的底物选择性还有待进一步研究，这些不仅可以健全三色堇花色形成相关体系，还能够为其他植物的花斑研究提供依据。

在花青素的生物合成途径中，CHS、CHI和F3H属于第2阶段反应的关键酶，CHS、CHI和F3H3个基因的表达与否直接影响花青素的生物合成。近年来，关于CHS、CHI和F3H基因的研究主要集中于草本植物的花色代谢调控方面，如利用 RNA干扰技术，使夏堇(Toreniahybrida)中的CHS基因沉默，干扰了花色苷合成，从而将蓝色花变为白色和灰白色花[26]；矮牵牛中CHI基因突变后使得查尔酮积累，从而使花粉呈黄色或绿色[27]；通过RNA干扰技术处理蓝紫色夏堇F3H基因，获得白色花[28]。当然人为调控花色代谢的手段还包括：导入外源基因或增加调节基因、改变环境因素等，这些也可以达到调控花色的目的，但是如果需要定向调控花色还是困难重重。本研究通过对三色堇花青素生物合成途径中CHS、CHI和F3H基因的克隆与生物信息学分析，不仅获得了它们的全长序列，还对这些基因的结构和功能进行了研究，在丰富基因信息的同时还为健全花青素合成体系提供了一定理论支持。当然，植物次生代谢调控是极其复杂的过程，并非靠个别酶就能完成，对于花青素生物合成途径中其他结构基因以及调控基因的研究也十分重要，因此在以后的三色堇花色形成机理研究中可以结合其他的影响因子综合考虑。

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Cloning and bioinformatics analysis of three structural genes involved in anthocyanin synthesis ofViola×wittrockiana

GONG Sheng,SUN Hai-yan,ZHANG Ke,ZENG Yuan,LI Jing,WANG Jian,LI Xin-guo

(KeyLaboratoryofProtectionandDevelopmentUtilizationofTropicalCropGermplasmResources,MinistryofEducation,CollegeofHorticulture&LandscapeArchitecture,HainanUniversity,Haikou，Hainan570228,China)

【Objective】 Cloning and bioinformatics analysis were conducted for three genes,VwCHS,VwCHIandVwF3H,which are involved in anthocyanin synthesis of pansy.【Method】 The full-length cDNA ofVwCHS,VwCHIandVwF3Hwere cloned by RACE/PCR,and bioinformatics analysis was carried out through online software.【Result】 The full-length cDNA ofVwCHS,VwCHIandVwF3Hwere 1 481,975 and 1 361 bp,respectively.Multiple sequence alignment revealed that the amino acids encoded by the three structural genes had high identity compared to other plants (62%-90%).There were four active sites (Cys171,Phe222,His310,and Asn343) in the amino acids sequences of CHS,four active sites (Thr50,Tyr108,Asn115,and Ser192) in CHI,and five active sites (Asp218,His253,Arg215,Arg284,and Ser286) in F3H.Their molecular weights were 9.91,5.37 and 4.1 ku,and their pI values were 5.02,5.16 and 5.44,respectively.The secondary structure prediction revealed that the secondary structures of VwCHS and VwCHI protein mainly contained α helix with ratios of 43.39% and 41.89% respectively, while VwF3H protein was mainly random coil with a ratio of 42.30%.Phylogenic analysis showed that each of the three proteins belonged to the corresponding protein family cluster.【Conclusion】 VwCHS,VwCHI and VwF3H were non-transmembrane proteins without signal peptide.

Viola×wittrockiana;chalcone synthase (CHS);chalcone isomerase (CHI);flavanone-3-hydroxylase (F3H);bioinformatics analysis;gene clone

2014-12-05

国家自然科学基金项目(31060265，31260488)；海南大学中西部计划学科建设项目(ZXBJH-XK008)

龚 胜(1989-)，男，四川资阳人，在读硕士，主要从事园林植物资源与遗传改良研究。E-mail：156217591@qq.com

王 健(1977-)，男，湖北宜昌人，副教授，博士，硕士生导师，主要从事园林植物分子生物学研究。 E-mail：wjhnau@163.com

时间:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.010

Q785

A

1671-9387(2015)07-0133-10

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.010.html