杜仲愈伤组织诱导和植株再生体系的建立

王 征，伍江波，刘雪梅，金晓玲

(中南林业科技大学 风景园林学院，湖南 长沙 410004)

杜仲愈伤组织诱导和植株再生体系的建立

王 征，伍江波，刘雪梅，金晓玲

(中南林业科技大学 风景园林学院，湖南 长沙 410004)

【目的】 研究在BA、NAA、IBA、2,4-D等激素作用下，杜仲愈伤组织诱导、愈伤组织诱导丛生芽及丛生芽诱导生根各阶段的最佳培养基配方，建立杜仲植株再生体系，为杜仲转基因研究提供基础材料。【方法】 以杜仲成熟胚、幼嫩胚、叶片和茎段为外植体，使用BA、NAA、IBA、2,4-D等激素，配制成不同质量浓度的培养基，进行杜仲愈伤组织诱导，同时分析愈伤组织诱导丛生芽和丛生芽诱导生根培养基的最佳配方，建立杜仲植株的再生体系。【结果】 杜仲愈伤组织诱导的培养基分别为：成熟胚MS+BA 2.0 mg/L+NAA 2.5 mg/L， 诱导率77.8%；幼嫩胚MS+BA 0.5 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L， 诱导率88.9%；叶片MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L， 诱导率100%；茎段MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，诱导率为100%。愈伤组织诱导不定芽形成的适宜培养基为MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L，不定芽诱导率为88.9%，增殖系数为3±1；杜仲在1/4MS的基本培养基中生根最好，生根率达80%，激素的存在反而会抑制生根。【结论】 杜仲成熟胚、幼嫩胚、叶片和茎段均可通过愈伤组织途径诱导不定芽的形成，并诱导生根，建立杜仲愈伤组织再生体系，但不定芽的增殖系数较低。

杜仲；成熟胚；继代周期；不定芽；愈伤组织

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)为杜仲科杜仲属，是第三纪孑遗植物[1],为国家二级保护植物[2]。杜仲是传统的名贵中药，其所含的绿原酸、桃叶珊瑚苷和黄酮类物质具有调节血压、降血糖和增强免疫力等功能[3-5]。另外，杜仲组织器官内所含的杜仲胶具有独特的“橡胶-塑料二重性”，这大大地拓展了杜仲的应用领域[6]。目前，国内外相关的研究主要集中在杜仲的栽培、繁殖、化学成分及遗传学等方面[7-11]。杜仲不同品种间的有效成分和杜仲胶含量差异很大[12]。于20世纪90年代起，国家林业局泡桐研究开发中心等单位率先选育出了“华仲01”～“华仲05”等5个杜仲优良无性系，填补了我国杜仲良种的空白[13]。目前，有关杜仲主要有效成分绿原酸和杜仲胶的合成途径已经阐明，其中的关键酶也被发现，使得利用转基因技术获得高产杜仲新品种的设想成为可能[14]。虽然杜仲的组织培养在实验室层面已经获得成功，但是仍然有许多的问题，如初代诱导出芽率低，易污染，丛生芽增殖系数低等，这些都严重影响着杜仲组织培养的发展，并制约了杜仲组织培养工厂化生产技术的推广和应用。为此，本研究以杜仲多种组织为外植体进行愈伤组织诱导，在MS培养基中添加不同质量浓度组合的NAA、BA、IBA、2,4-D等激素，分析愈伤组织诱导效果，获得愈伤组织诱导、不定芽诱导及生根诱导的最佳培养基配方，建立了完整的杜仲植株再生体系，以期为杜仲转基因研究提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为国家林业局经济林研究所培育的“华仲05”优良植株。所用的外植体类型有：成熟胚、幼嫩胚、茎段和叶片，愈伤组织及不定芽。

1.2 方 法

1.2.1 不同外植体诱导愈伤组织条件的确定 在愈伤组织诱导阶段，试验中所使用的外植体类型有成熟胚、幼嫩胚、茎段、叶片。外植体经酒精消毒后再使用质量分数0.1%升汞溶液振荡消毒1 min，并切成0.5 cm的长段备用。

(1)在以成熟胚和叶片为外植体进行愈伤组织诱导时，均以MS为基本培养基，并添加不同质量浓度的生长素NAA和细胞分裂素BA，构成14个组合(表1)。

(2)在以幼嫩胚为外植体进行愈伤组织诱导时，以MS为基本培养基，添加不同质量浓度的生长素NAA、2,4-D和细胞分裂素BA，构成10个组合(表2)。

(3)在以茎段为外植体进行愈伤组织诱导时，以MS为基本培养基，添加不同质量浓度的生长素NAA和细胞分裂素BA，构成9个组合(表3)。

将上述不同外植体接种在不同组合的MS培养基中培养，30 d后统计愈伤组织诱导率。以判断杜仲不同外植体类型诱导愈伤组织的最佳条件。

1.2.2 愈伤组织诱导不定芽条件的确定 试验中的外植体为黄绿色愈伤组织，从无菌培养基中取出，因此无需消毒处理，直接将其切成0.5 cm×0.5 cm的块状备用。基本培养基为MS，培养基中添加不同质量浓度的生长素NAA和细胞分裂素BA，共构成10个组合(表4)。将外植体接种于不同组合的MS培养基上， 30 d后统计不定芽诱导率，计算增殖系数。

1.2.3 不定芽诱导生根条件的确定 试验中使用的外植体为长3～4 cm的不定芽。在研究植物激素剂量配比对杜仲不定芽生根情况的影响时，以1/2MS为基本培养基，添加不同质量浓度的细胞分裂素IBA和生长素NAA，共构成6个组合(表5)。另外，分别以培养基MS、1/2MS、1/4MS为基本培养基，附加细胞分裂素IBA 0.2 mg/L，以确定不同无机盐离子强度对杜仲不定芽生根情况的影响。

1.3 数据处理

所有试验每组均接种12个外植体，重复3次。培养30 d后，观察记录愈伤组织、不定芽和根的生长状况，统计愈伤组织和不定芽的诱导率及生根率。培养条件为：(25±2) ℃，光照强度为2 500 lx，光照周期为15 h/d。

愈伤组织诱导率=诱导出愈伤组织的外植体数/供试外植体数×100%；

不定芽诱导率=出现不定芽的外植体数/供试外植体数×100%；

增殖系数=愈伤组织诱导出的不定芽总数/组合数；

生根率=可见生根的外植体数/供试外植体数×100%。

2 结果与分析

2.1 杜仲不同外植体诱导愈伤组织条件的确定

2.1.1 以成熟胚为外植体 从表6可以看出，杜仲成熟胚诱导愈伤组织需要激素参与，单独使用NAA不能诱导愈伤组织形成，BA与NAA混合使用(愈伤组织生长正常且整体诱导率较高)的效果要好于单独使用BA(愈伤褐化，诱导率低)。其中以添加BA 2.0 mg/L+NAA 2.5 mg/L的MS培养基愈伤组织诱导率最高,达77.8%，而且愈伤组织的生长正常，质地疏松，颜色为黄色，此类愈伤组织经过继代培养，可以诱导形成不定芽(图1-1)。

2.1.2 以幼嫩胚为外植体 表7结果表明，在BA和2,4-D组合中，杜仲幼嫩胚均能正常诱导出愈伤组织，其中以MS+BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L 最好(图1-2)， 诱导率达88.9%。而在BA和NAA的组合中，没有诱导出愈伤组织，外植体缓慢变黑，坏死。无激素的培养基中同样未能诱导出愈伤组织，外植体坏死。

2.1.3 以叶片为外植体 由表8可见，以杜仲叶片为外植体时，单独使用BA无法诱导出愈伤组织，叶片膨大、缓慢干枯死亡。单独使用NAA时，只有叶片边缘出现小块分散的嫩黄色愈伤组织，且长势较差。只有BA和NAA配合使用才能诱导出比较好的愈伤组织，但是由于黄绿色愈伤组织在芽诱导阶段具有较好的细胞再分化能力，因此选择MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L作为最佳培养基，诱导率达100%，此类愈伤组织经过继代培养，可以诱导形成不定芽(图1-3)。

注：小块为分散在叶边缘的愈伤，中等为体积超过叶面积一半的愈伤，大块为全部发育成愈伤。长势分为3级：较差、一般、较好。表10，11同。

Note:A small piece is the small callus scattered on the edge of the leaf,medium is the general callus with size bigger than leaf area,large is well developed callus.The growth vigor is divided into three levels:poor,general and good.The same table 10 and 11.

为了进一步了解不同组合对叶片诱导愈伤组织的影响及不同激素之间的关系，对叶片愈伤组织诱导率进行多因素方差分析，结果见表9。从表9可以看出，处理的总效应(指BA与NAA 2种激素共同参与试验时，两者之间交互作用对试验结果的影响)P=0<0.05达到了显著水平，说明BA和NAA之间的交互效应显著，二者的交互作用对试验结果产生了显著影响。

2.1.4 以茎段为外植体 由表10可见，单独使用BA时，以杜仲茎段为外植体愈伤组织的诱导率较低，且颜色深绿，长势较差，质地紧密，不利于继代增殖和芽诱导。单独使用NAA时，在试验范围内，愈伤组织的诱导率均较高，其中以1.5 mg/L最高，达到100%；随着NAA质量浓度的升高，诱导率逐渐降低，总体上诱导率呈抛物线趋势。当BA质量浓度为2.0 mg/L，NAA质量浓度为0.5 mg/L时，愈伤组织诱导率也达到100%，且颜色为绿色，长势均良好，此类愈伤组织经过继代培养，可以诱导形成不定芽(图1-4)。

2.2 杜仲愈伤组织不定芽的诱导条件

由表11可以看出，杜仲愈伤组织丛生芽的诱导需要有BA或BA和NAA同时存在，但以BA与NAA混合使用的效果较好。从不定芽的诱导率和增殖系数综合考虑，适合杜仲愈伤组织丛生芽诱导的培养基为：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L(图2)。

注：增殖系数为每个愈伤上的丛生芽平均值±标准差。

Note:k-factors are average±standard deviation of multiple shoot clumps.

2.3 杜仲不定芽生根的培养条件

2.3.1 IBA和NAA单因素作用于杜仲无菌苗的生根培养 由表12可以看出，杜仲不定芽在没有激素的情况下容易生根，生根率最高达到72%，并且根从苗基部长出，粗壮不易脱落，无愈伤组织出现(图3-1)。而激素的存在反而会抑制根的诱导。

2.3.2 不同培养基中的生根情况 由表13可见，在激素IBA质量浓度相同时，随着培养基中无机盐离子强度的降低，杜仲不定芽生根率逐渐上升，其中在MS培养基中，植株所长出的根比较短，但粗壮；而在1/2MS和1/4MS培养基中，植株所长出的根数量明显增多，长度略有增加，有利于炼苗后的移栽。因此，最适合杜仲幼苗生根培养的培养基配方是1/4MS(图3-2)。

3 结论与讨论

本研究结果表明，杜仲愈伤组织诱导的培养基分别为：成熟胚MS+BA 2.0 mg/L+NAA 2.5 mg/L， 诱导率77.8%；幼嫩胚MS+BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L， 诱导率88.9%；叶片MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，诱导率100%；茎段MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，诱导率100%。成熟胚、叶片和茎段诱导的愈伤组织为黄绿色，经过继代培养可以诱导不定芽；但是，幼嫩胚诱导的愈伤组织为乳白色，继代培养后不能产生不定芽，反而褐化死亡。

杜仲愈伤组织诱导不定芽形成的适合培养基为MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L，不定芽诱导率88.9%，增殖系数为3±1。杜仲的不定芽诱导率不高，且增殖系数较低，这可能是杜仲组织培养途径能否在生产上应用的一个关键，提高不定芽增殖系数的方法还有待进一步研究[15-16]。

杜仲的生根相对比较容易，在1/4MS的基本培养基中生根率达80%，激素的存在不利于生根，这是否是由于杜仲不定芽的内源激素水平较高，足够满足生根的要求，还有待进一步探讨。

本研究发现，杜仲在各个生长阶段对外界营养物质的需求不同。在初代和增殖培养中，较高浓度的无机盐即MS培养基比较适合，而在生根培养中，低浓度的无机盐对于生根更加有利。这与前人研究结果，即大多数木本植物组织培养中对无机盐浓度的需求规律相同[17]。

在愈伤组织的增殖研究中，褐化现象较为明显和普遍。推测可能的原因有以下几个方面：①愈伤组织创伤面较多，造成多种化合物和酶接触发生氧化反应，形成有毒物质；②继代时间过长；③植物生长调节剂的浓度不合适。Rolland等[18]研究发现，在接种时外植体一旦被切割，在切伤的组织细胞表面，酚类化合物和多酚氧化酶就会接触发生氧化反应，然后形成有毒的醌类物质，从而导致褐化的发生。这种毒性物质会逐渐扩散到培养基中，抑制植物组织体内其他酶的活性，使组织代谢紊乱，对于外植体的分化和脱分化都会产生巨大的不利影响，甚至导致外植体死亡。本研究也在一定程度上印证了上述结论。针对以上问题，本试验采取了几种措施以降低杜仲植株的褐化：①尽量减少愈伤组织的创伤面积，频繁更换刀片，使得创面尽量平整；②在愈伤组织旺盛生长期即将结束时就进行愈伤的下一次继代培养，使得组织体内各种酶的活性和新陈代谢速率继续维持；③在不影响诱导率和增殖系数的前提下，适当降低植物生长调节剂的质量浓度。

[1] 张宏达.中国植物志(第三十五卷第二分册) [M].北京:科学出版社,1979:27.

Zhang H D.The flora of China (the archies of 35 (2)) [M].Beijing:Sciences Press,1979:27.(in Chinese)

[2] 国家环境保护局,中国科学院植物研究所.中国珍稀濒危保护植物名录植物(第一册) [M].北京:科学出版社，1987:2.

State Environmental Protection Agency & Institute of Botany,the Chinese Academy of Sciences.The list of rare and endangered plants plants (volume 1) [M].Beijing:Science Press,1987:2.(in Chinese)

[3] 金晓玲,杜红岩,李 钦.杜仲雄花茶对小鼠抗疲劳作用的研究 [J].食品科学,2008,29(7):432-434.

Jin X L,Du H Y,Li Q.Study on anti-fatigue effects ofEucommiaulmoidesmale flower tea on mice [J].Journal of Food Science,2008,29(7):432-434.(in Chinese)

[4] 王亚琴,张康健.杜仲次生代谢产物的研究进展 [J].中草药,2004,7(7):836-839.

Wang Y Q,Zhang K J.Advances in research on secondary metabolites ofEucommiaulmoides[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs,2004,7(7):836-839.(in Chinese)

[5] 徐诗伦,黄武光,刘 敏,等.杜仲对体液免疫功能的影响 [J].中药通报,1986,11(3):54-56.

Xu S L,Huang W G,Liu M,et al.Eucommiaulmoidesinfluence on humoral immune function [J].Journal of Traditional Chinese Medicine Bulletin,1986,11(3):54-56.(in Chinese)

[6] 杜红岩.我国的杜仲胶资源及其开发潜力与产业发展思路 [J].经济林研究,2010,28(3):1-6.

Du H Y.Discussion on industry development and exploration potential of gutta-percha resource in China [J].Nonwood Forest Research,2010,28(3):1-6.(in Chinese)

[7] 魏永成,李周岐,李 煜,等.杜仲杂交子代苗期表型性状的遗传分析 [J].西北农林科技大学学报:自然科学版,2012,40(8):137-143.

Wei Y C,Li Z Q,Li Y,et al.Genetic analysis of morphological traits ofEucommiaulmoidesOlivers hybrid offspring [J].Journal of Northwest A&F University:Nat Sci Ed,2012,40(8):137-143.(in Chinese)

[8] 王大玮,李 煜,周 玮,等.杜仲AFLP反应体系的建立及优化 [J].西北农林科技大学学报:自然科学版,2010,38(6):88-93.

Wang D W,Li Y,Zhou W,et al.Establishment and optimization of AFLP reaction system inEucommiaulmoidesOliv. [J].Journal of Northwest A&F University:Nat Sci Ed,2010,38(6):88-93.(in Chinese)

[9] 刘攀峰,杜红岩,乌云塔娜,等.杜仲HDR基因全长cDNA克隆与序列分析 [J].林业科学研究,2013,26(4):447-453．

Liu P F,Du H Y,Wu Y T N,et al.Cloning and sequence analysis of 1-Hydroxy-2-Methyl-2-E-Butenyl-4-Diphosphate reductase gene cDNA fromEucommiaulmoides[J].Forest Research,2013,26(4):447-453.(in Chinese)

[10] 李 琰,张朝红,崔宏安,等.杜仲愈伤组织诱导的研究 [J].西北农林科技大学学报：自然科学版,2003,31(5):153-156.

Li Y,Zhang C H,Cui H A,et al.Study ofEucommiaulmoidescallus induction [J].Journal of Northwest A&F University:Nat Sci Ed,2003,31(5):153-156.(in Chinese)

[11] 王弦云,朱晓敏,王 勤,等.杜仲 ISSR-PCR 反应体系的建立与引物筛选及其在遗传多样性研究中的应用 [J].经济林研究,2013,31(1):30-34.

Wang X Y,Zhu X M,Wang Q,et al.Establishment of ISSR-PCR reaction system,primers screening and their applications to genetic diversity analysis inEucommiaulmoides[J].Nonwood Forest Research,2013,31(1):30-34.(in Chinese)

[12] 杜红岩,李芳东,杜兰英,等.不同产地杜仲果实形态特征及含胶量的差异性研究 [J].林业科学，2006,42(3):35-39．

Du H Y,Li F D,Du L Y,et al.Difference of Samara’s form characters and gutta_percha content from different producing areas associated withEucommiaulmoides[J].Scientia Silvae Sinicae,2006,42(3):35-39.(in Chinese)

[13] 杜红岩,乌云塔娜,杜兰英.杜仲高产胶优良无性系的选育 [J].中南林业科技大学学报,2006,26(1):6-11．

Du H Y,Wu Y T N,Du L Y,et al.Selection of high-yielding gutta-percha clones associated withEucommiaulmoidesOliv. [J].Journal of Central South University of Forestry & Technology:Social Sciences,2006,26(1):6-11.(in Chinese)

[14] 黄海燕,杜红岩,乌云塔娜,等.基于杜仲转录组序列的SSR分子标记的开发 [J].林业科学,2013,49(5):176-181．

Huang H Y,Du H Y,Wu Y T N,et al.Development of SSR molecular markers based on transcriptome sequencing ofEucommiaulmoides[J].Scientia Silvae Sinicae,2013,49(5):176-181.(in Chinese)

[15] 王 征,金晓玲,刘雪梅,等.杜仲成熟胚器官发生途径的研究 [J].中南林业科技大学学报,2013,33(6):79-83,93．

Wang Z,Jin X L,Liu X M,et al.Study on organogenesis approaches ofEucommiaulmoidesbark mature embryos [J].Journal of Central South University of Forestry & Technology:Social Sciences,2013,33(6):79-83,93.(in Chinese)

[16] 唐 亮,金晓玲.杜仲组织培养的研究进展 [J].贵州农业科学,2010,38(3):15-18．

Tang L,Jin X L.Advance in tissue culture ofEucommiaulmoides[J].Guizhou Agricultural Sciences,2010,38(3):15-18.(in Chinese)

[17] 夏 晗.珙桐组织培养技术体系研究 [D].四川雅安:四川农业大学,2003.

Xia H.Tissue culture technology system research ofDavidiainvolucrataBaill. [D].Ya’an,Sichuan:Sichuan Agricultural University,2003.(in Chinese)

[18] Rolland F,Baena-Gonzalez E,Sheen J.Sugar sensing and signaling in plants:Conserved and novel mechanisms [J].Annu Rev Plant Biol,2006,57:675-709.

Establishment of callus induction and regeneration system forEucommiaulmoidesOliver

WANG Zheng,WU Jiang-bo,LIU Xue-mei,JIN Xiao-ling

(CollegeofLandscapeArchitecture,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha,Hunan410004,China)

【Objective】 In order to provide basis for transgenic research on bark ofEucommiaulmoidesOliver,the paper established theEommiaulmoidesregeneration system by studying the optimal culture medium for induced callus,induced adventitious bud,and adventitious bud induced roots.【Method】 Mature embryos,young embryos,leaf,and stem were used to find the influence of type and concentration of hormones (BA,NAA,IBA,and 2,4-D) on callus induction,subculture,and rooting ofEucommiaulmoidesOliver.【Result】 All explants could induce callus,but different media were needed.Medium of mature embryo was MS+BA 2.0 mg/L+NAA 2.5 mg/L with induction rate of 77.8%.Medium of young embryos was MS+BA 0.5 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L with induction rate of more than 88.9%.Medium of leaf blade was MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L with induction rate of 100%.Medium of stem section was MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L,with induction rate of 100%.Medium of adventitious bud from callus media was MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L with induction rate of 88.9%,growth rate of 3±1.Rooting medium was 1/4MS with rooting rate of 80%.【Conclusion】 Mature embryo and immature embryo,leaf and stem section ofEucommiaulmoidescan establish regeneration system through callus,but thek-factor of adventitious bud was low.

EucommiaulmoidesOliver;mature embryos;subculture time;adventitious bud;callus

2013-12-20

“十二五”农村领域国家科技计划项目(2012BAD21B0502)

王 征(1986-)，男，河南新乡人，硕士，主要从事园林植物与观赏园艺研究。E-mail：362139780@qq.com

金晓玲(1963-)，女，浙江东阳人，教授，博士生导师，主要从事园林植物繁育技术研究。 E-mail：jxl0716@hotmail.com

时间:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.032

S336；Q813.1

A

1671-9387(2015)07-0057-09

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.032.html