口蹄疫诊断技术研究进展

李岩（黑龙江省绥化市青冈县畜牧兽医局，黑龙江 青冈 151600）

口蹄疫诊断技术研究进展

李岩
（黑龙江省绥化市青冈县畜牧兽医局，黑龙江 青冈 151600）

为了系统地了解口蹄疫诊断技术，本文概述了口蹄疫的病原学、血清学与分子生物学诊断技术。传统的病原学诊断主要依赖于动物接种以及细胞培养，用于病毒的增殖、分离和鉴定。血清学诊断技术则包括补体结合试验、病毒中和试验、凝集试验和酶联免疫吸附试验等。随着分子生物学的发展，对口蹄疫的诊断从细胞水平发展到分子水平，国内外相继建立了口蹄疫核酸杂交和反转录聚合酶链反应等分子生物学诊断技术。这些方法比传统诊断方法具有更高的敏感性和特异性。

口蹄疫；诊断技术；病原学；血清学；分子生物学

口蹄疫（Foot and mouth disease，FMD）是偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，是目前影响动物健康的重要疫病之一，世界大部分地区均有发生，常在牛群及猪群大范围流行。此病的致死率很低，但是感染率很高。FMD的大规模流行，会给农牧业生产造成极大的危害，并波及到市场上毛、皮、肉、奶的供应以及以毛、皮、肉、奶为原料的食品加工业和轻工业，给畜牧业和进出口贸易造成巨大的经济损失，直接威胁着国家声誉和人类食品卫生安全，因而受到国内外的普遍关注。世界动物卫生组织（OIE）将该病列为A类家畜传染病之首。口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，FMDV）为单股、正链RNA，约有8 500个核苷酸，病毒衣壳由4种结构蛋白即VP1、VP2、VP3和VP4各60个拷贝组成，其中VP1和VP3是主要的免疫性抗原。该病毒共有7个血清型分别为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1型，每个型又可以进一步分为亚型。由于不断发生抗原漂移，因此并不能严格区分亚型。FMD在世界各地几乎都被列为必须申报的疾病，诊断只能在指定的实验室进行。送检样品包括水泡液、剥落的水泡、抗凝血或血清等。死亡动物可采集淋巴结、扁桃体及心脏。样品应冰冻保存，或置pH 7.6的甘油缓冲液中保存[1]。FMD的有效控制关键在于早期检测，然而有很多疾病症状与FMD相似，仅靠临床症状难以确诊，因此必须进行实验室诊断[2]。现就目前常用的诊断方法作以综述。

1 传统的病原学诊断方法

病毒分离技术是检测FMDV的黄金标准，主要有细胞培养和动物接种两种方法[3]。

1.1 细胞培养病毒检测FMDV最初用的细胞是单层原代猪肾细胞，后来随着细胞培养系统的不断增多，有许多细胞都可用于FMDV的分离。其中初代小牛甲状腺（CYT）细胞分离FMDV时特别敏感，此外还有小牛肾细胞、仓鼠肾细胞系BHK-21等。一些样品在经过长途运送后，由于病料受到各种因素的影响，可能只有少量的感染病毒存活，CYT细胞在检测这种病料时具有特殊的价值。目前许多实验室都将CYT细胞和IB-RS-2培养细胞（猪肾细胞系）作为分离FMDV的常规细胞。这两种细胞系可将FMDV和SVDV（猪水泡病病毒）区分开，因为FMDV可在这2种细胞上生长，且有相似的细胞病变，而SVDV只能在IBRS-2细胞上生长。

1.2动物接种试验动物接种常用乳鼠进行，通常情况下进行病毒分离需要用8～10只小鼠，以便于观察接种鼠的死亡情况和获得足够多的抗原，并在进行补体结合试验时需要获得明显的阳性结果。当致病性毒株非常重要时，也可用牛等动物来分离FMDV[4]。

血清学诊断技术主要包括补体结合试验、中和试验、凝集试验和ELISA等。

2 血清学诊断技术

2.1 补体结合试验1952年Brooksby建立了补体结合试验，它是最早标准化的检测方法，成功地用于FMDV分型鉴定，一直被世界参考实验室和FMD研究或定型中心应用至今[5]。在有补体存在的条件下，溶血素能溶解红细胞，这三者构成的溶血系统在补体结合试验中起显示作用。该方法可鉴定抗原（水泡皮、水泡液、鼠组织毒，而细胞毒需浓缩后方可检测），亦可鉴定抗体，并可进行定量测定。一般用常量补体结合试验为待检血清定型，微量补体结合试验用于亚型和毒株抗原差异分析。

2.2 病毒中和试验中和试验也称血清中和试验，该方法是最经典和最具权威性的FMDV检测方法。20世纪70年代末期，Rweyemamu等[6]建立中和试验。中和试验是利用血清中和抗体与病毒的特异中和作用，使病毒对易感动物和敏感细胞失去感染能力的原理建立的。根据接种病毒——血清混合物的动物发病死亡数或产生细胞病变的细胞管数来判定血清中所含抗体的量和型别。检测病毒——血清混合物的方法有乳鼠中和试验、细胞中和试验、微量细胞中和试验和空斑减少中和试验。中和试验既可定性又可定量，国际检疫条款规定用此法判定进出境动物是否感染或携带FMDV。

2.3 凝集试验

2.3.1 正向间接血凝试验 是当前最为快速、简便和经济的检测血清方法[7]。是将灭活的各型FMDV致敏绵羊红细胞制备的诊断试剂，当其遇到相应型的血清时即可发生红细胞凝集现象。可检测出猪和牛发病后10～150 d的血清抗体。其灵敏度高于中和试验和琼脂扩散试验，但缺点是不同批号的产品效价有波动。

2.3.2 反向间接血凝试验 是将各型血清的IgG致敏绵羊红细胞，当其遇到相应型抗原时即可发生红细胞凝集现象，这一方法和补体结合反应一样不能直接检测淋巴结和骨髓中的FMDV，须经乳鼠传代增毒后再研磨鼠组织，制成悬液，然后离心测定上清液。

2.4 酶联免疫吸附试验（EELLIISSAA）ELISA试验检测FMDV具有特异、敏感、快速、简便和可靠性好等特点，且能自动化操作，并能迅速地检测大量样品，在FMD的诊断中日益受到人们的重视，现已成为国际上检测FMD的常规方法之一。

杨永钦等[8]建立了检测FMDV的斑点ELISA检测方法（分为一步法和间接法）结果证实，用硝酸纤维素膜作固相载体，很好地解决了在常规ELISA中使用的聚苯乙烯微量反应板对抗原或抗体包被不牢的缺点，提高了诊断的准确性和可靠性，而且可以制成方便携带的诊断膜，应用更为方便，而且操作简单，缩短了试验周期，完全可以在野外进行实地诊断检测，在基层具有良好的推广前景，但是由于一步法的操作更为简化，敏感性稍有下降。杨永钦[9]还研制出用于检测FMDV的生物素-亲和素强化斑点ELISA试验方法，用光敏素标记的纯化A蛋白代替第二抗体，通过AP标记的亲和素检测生物素化抗体，该法能检出微量抗体，比常规ELISA更为敏感。Sorensen等建立了可检测FMD抗SAT1、SAT2、SAT3血清型病毒抗体的生物素—亲和素系统阻断ELISA方法，并与世界参考实验室的液相ELISA方法进行了比较，结果证实，该方法具有高特异性和灵敏性，可作为抗体水平评估的一种精确可行的方法。

美国联合生物制药公司于2000年成功推出以合成肽为基础的FMD ELISA试剂盒，目前已在世界多个国家和地区使用。该试剂盒是根据传统的ELISA方法设计的，所不同的是采用的包被抗原是化学合成的非结构蛋白3B和结构蛋白VP1中的抗原位点来取代传统的病毒抗原或生物合成抗原，并可区分免疫抗体和感染抗体[10]。

De等研制出基于3ABC蛋白的间接捕获ELISA技术，可区分野毒感染和疫苗毒感染。该方法具有良好的敏感性和特异性。3ABC抗原的抗体最早可于免疫后8 d测出，并且抗体测出时间可长达至少1年。此ELISA方法安全、经济。鉴于其优良特点，可参与FMD根除运动和防控计划。Sorensen等[11]开发出以杆状病毒表达的抗原构建的ELISA方法，可分别检测非结构蛋白3AB、3ABC、3D，其中3AB、3ABC、3D ELISA均可检测FMDV的7种血清型病毒抗体。3DELISA与检测结构蛋白的ELISA方法相比，具有相当的特异性、准确性和敏感性，他们同时也可证实3AB和3ABC-ELISA，可在免疫后的畜群中判断是否存在野毒感染。Kweon等以杆状病毒表达的非结构蛋白3A为抗原，以抗3A的单抗作为捕获抗体，建立起间接捕获ELISA方法，此方法与3ABC-I-ELISA相比，具有较好的敏感性和特异性。

Cullough等建立了一种液相ELISA，此ELISA比间接ELISA敏感6～8倍，在效能上与双夹心或抗原捕获ELISA相当，可用于检测抗原抗体反应及杂交瘤细胞培养上清的检测。Hamblin等建立了用于检测FMDV抗体的液相阻断夹心ELISA，该方法比病毒中和试验更敏感，检出率更高。Oliver等将检测抗原的双抗体夹心ELISA与补体结合试验就检测抗原方面的效果进行了比较，结果表明，ELISA方法比补体结合试验具有更高的敏感性。

Van建立了可检测A、O、C型FMDV的单抗介导的复合型捕获阻断ELISA方法，在这个方法中，同时应用2个单抗分别针对抗原上不同的抗原决定簇，有感染力的、未灭活的和灭活的FMDV都可以应用于此ELISA方法中。此ELISA方法和其他ELISA方法一样，不仅敏感性好，而且诊断快速，可重复测定，其在疫苗效力试验中对免疫应答水平的评估非常实用。Odonneu等应用3D蛋白开发出3D液相阻断夹心ELISA用于检测FMDV抗体。此ELISA可检测自然或实验室感染的A、O、C型FMD抗体，感染后最早5 d即可测到抗体。此 ELISA方法可用于检测病毒活性及对未感染FMDV动物的证实。

Mackay等建立起诊断FMD的固相竞争ELISA方法，以灭活的纯化FMDV为抗原，并在系统中应用了多克隆抗血清，与液相阻断ELISA相比，敏感性与液相阻断ELISA相当。Chenard等建立了一种简便的固相阻断ELISA检测O型FMDV所刺激而产生的抗体。用此方法对感染和未感染FMDV的牛、猪和羊进行了大量的血清田间试验，结果证实，特异性为96%，对148份感染FMDV的猪、牛和羊的血清进行检测， 证实其敏感性大于99%，特异性和灵敏性满足ELISA的检测要求[12]。

Lomakina等建立了检测FMDV的PCR-ELISA方法，在PCR中应用的是针对3D蛋白基因的通用引物。应用该方法成功的检测到32株口蹄疫病毒株。

3 分子生物学诊断技术

3.1 核酸探针法即用放射性同位素标记核酸的cDNA拷贝，可以特异地同待检样品中的病毒核酸结合，这种结合可以通过放射自显影显现出来。这一方法是当前最敏感的方法。其缺点是试验程序较为繁琐，而且同位素标记半衰期短，并污染环境。相关学者用32P标记克隆在质粒上的FMDV基因组聚合酶序列作为探针，对试验感染牛的食道/咽部刮取物进行了检测，认为此法为进出口动物FMD检测提供了快速、准确的检测方法[13]。吴时友等将重组质粒中的FMDV基因片段提出，用光敏生物素标记成cDNA探针进行检测，可检测出10 pg以上的病毒核酸。杨永钦[18]应用cDNA探针成功检出了FMDV。苏卫等用PCR技术直接合成生物素化核酸探针，一方面可克服同位素探针的放射危害及半衰期短等缺点，另一方面也可克服生物素标记的复杂操作过程。

3.2 聚合酶链反应（PPCCRR）PCR诊断技术用于诊断FMD的报道始见于1991年。在使用时以特殊设计的引物作介导及在反转录酶的作用下再进行PCR扩增，扩增产物用PAGE、琼脂糖电泳或硝酸银染色检查，看扩增出的DNA片段大小与设计是否相符。Meyer采用PCR检测牛食道—咽部分泌物中的FMDV RNA；Laor在变化的VP1基因序列中选择引物，则可用于鉴别FMDV以色列株；国内吴时友等就FMDV的PCR检测研究作了报道；蒋正军等应用RT-PCR一步法和Nested-PCR法快速检测到A型10-6倍稀释、O型10-4倍稀释乳鼠肌肉毒。王伊琴等应用RT-PCR检测口蹄疫灭活疫苗中的病毒RNA。朱彩珠等采用RTPCR技术检测牛和猪组织中的FMDV，将FMDV的检测结果与常规法进行比较，灵敏度提高6～12倍，最高可检出20 TCID50细胞毒或0.16～0.32 LD50组织毒，2次扩增还可提高检出灵敏度100倍。娄高明等应用RT-PCR技术能准确快速地（8 h）检测肉类、奶类、分泌物及排泄物的带毒、排毒情况。罗长保等[14]应用荧光RT-PCR技术能检测出进口冻肉中的FMDV。PCR检测法与其他方法相比，其特点是特异性好，灵敏度高，简便快速，对检测样品要求低。在分子流行病学中RT-PCR可与序列分析结合研究不同分离株之间的系统关系，也有助于追踪该病暴发的传染源。

3.3 电聚焦运用电聚焦技术诊断FMD和进行FMDV的流行病学研究。电聚焦是根据等电点的不同来分离像蛋白质这样的两性电解物。FMDV的结构和成分比较简单.在电聚焦技术中，FMDV诱导的肽都能聚成清晰的、通常是单一的区带，而且成熟多肽数量少，能产生单一的电焦型，可在单向电聚焦时与其他病毒带对照比较，因此电聚焦技术在FMDV流行病学研究中，具有较大的研究潜力，能快速地、简单地、大量地分离病毒株，常被用于FMDV遗传变异等方面的研究。

4 其他诊断方法

用于诊断FMD的方法还有SPA偶联抗体法、基因工程改造细胞发光法、免疫金标记快速检测试纸法、自我染色复制法和色谱带试验等，其中色谱带试验敏感性等同于实验室的抗原ELISA，而且可在15 min内判定结果。由于控制FMDV的关键之一在于早期诊断，因此探索一种能够大量、快速、高效的检测方法将仍是今后研究的热点。在将来，一种同源分析的新型ELISA也许会应用于诊断FMD的血清学试验中，这种新型ELISA比传统的需要洗板的ELISA方法更适合于机器操作。另外，基因芯片和蛋白上清检测系统也将最终应用于FMD的检测技术。

综上所述，对FMD的诊断仍然依赖于传统的流行病学并结合新的生物技术方法。经典的病毒分离、补体结合试验和病毒中和试验可靠准确，目前仍在使用，但FMD病毒分离培养工作量较大，病料采样的部位、时间、样品处理、病程类型、发病动物的抗病毒抗体水平等因素对病毒分离成功与否有一定的影响，而最主要的是分离病毒的细胞是否敏感和有效。补体结合试验有些样品中存在抗补体活性，影响检测结果；体外病毒中和试验需要单层培养细胞，细胞生长变化不均，病毒对细胞适应性有别，细胞易受细菌和霉形体的污染，并且有些血清样品对细胞有毒性。

随着分子生物学技术迅速发展及其在FMD诊断中的应用，建立了多种FMD的分子生物学诊断技术。从动物试验到血清学试验以至分子生物学诊断技术，特异性越来越好，灵敏度越来越高，被检样品的局限性愈来愈小，具有较大应用潜力的方法有补体结合试验、病毒中和试验、ELISA、PCR和病毒基因组核苷酸序列分析。

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The progress in diagnosis technology of foot and mouth disease

Li Yan

（Animal husbandry and veterinary bureau of Qinggang,Heilongjiang Qinggang 151600）

To systematically understand the diagnosis technology of FMD,this paper summarizes the diagnosis technology of FMD including etiological,serological and molecular biological diagnosis technology.In terms of biological diagnostic technology,the diagnosis methods of FMD mainly rely on animal experiments,cell culture.The serological diagnosis technologies including complement fixation test,virus neutralization test,agglutination test,enzyme-linked immunosorbent assay.With the development of molecular biology,the molecular diagnosis technologies of FMD become more important.These methods including nucleic acid hybridization,RT-PCR,and so on,which have higher sensitivity and specificity than the traditional diagnosis method.

Foot and mouth disease;Diagnostic technology;Etiology;Serology;Molecular biology

S855.3

A

1672-9692(2015)12-0038-05

2015-10-27

李岩（1974-），男，本科，高级兽医师，兽医站长，主要从事动物疾病防治。