膝骨关节炎的骨髓间充质干细胞疗法

王向辉，丁琼浩

(1. 河南省巩义市中医院，河南 巩义 451200；2. 四川省内江市中医院，四川 内江 610072)

膝骨关节炎的骨髓间充质干细胞疗法

王向辉1，丁琼浩2

(1. 河南省巩义市中医院，河南 巩义 451200；2. 四川省内江市中医院，四川 内江 610072)

膝骨关节炎；软骨组织；软骨修复；组织工程；间充质干细胞；载体支架；生长因子

膝骨关节炎是中老年人常见的关节退行性病变。骨关节炎是以关节软骨破坏及关节边缘和软骨下骨质再生为特征的慢性关节疾病。本病病理核心是关节软骨的损伤及骨赘形成。目前认为本病是多因素联合作用的结果：软骨基质合成与分解代谢失调，软骨下骨板损害使软骨失去缓冲作用，关节内局灶性炎症[1]。临床常见患者膝关节的疼痛、晨僵、肿胀、摩擦音及畸形，严重影响了中老年人的生活质量。近年骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)广泛用于膝骨关节炎的治疗，现将研究进展情况综述如下。

1 软骨的生理结构、损伤与修复特点

关节软骨主要由软骨细胞与基质组成。其中，软骨细胞占成熟组织体积的10%以下，负责维持基质。基质主要由水(占70%～85%)、Ⅱ型胶原(占10%～20%)、蛋白多糖(占5%～10%)组成。关节软骨主要靠滑液的弥散来获取营养，只有在反复负载的情况下才能保持正常的代谢。

软骨组织无血管、神经及淋巴引流。故成年的软骨一旦破坏，因缺乏血供则不能使纤维蛋白凝块形成，或炎性细胞和未分化细胞从血管迁移到组织损伤部位进行修复。此外，软骨缺少能够迁移、增殖并参与修复反应的未分化细胞。而仅有的高分化的软骨细胞，既无法穿过致密的胶原-蛋白多糖基质到达受损处，又不能很好促进基质合成。

临床常见的修复软骨损伤的方法有：传统的包括骨软骨成形术、软骨下骨钻孔术、微骨折术，组织工程学治疗包括骨膜或软骨膜移植术、自体(马赛克成形术)或异体骨软骨移植、自体软骨细胞种植(ACI)、基质诱导的自体软骨细胞移植(MACI)、关节软骨原位再生技术以及干细胞治疗等。①骨软骨成形术是关节镜下对受损软骨进行机械磨削至出血，诱发自身的修复，同时也减少活动时的摩擦。由于缺乏前瞻性的临床随机对照研究，此术式的有效性还不确定[2]。②软骨下骨钻孔术即从软骨缺损的区域向软骨下骨板钻孔至出血，但钻孔时产生大量热量，易使周围骨质坏死；且再生的组织结构复杂，耐磨性差；术后易发生关节的炎症。③微骨折术即在关节镜下清除受损软骨及钙化软骨层，用锥钻在软骨下骨上打孔至出血，使孔中渗出的血液和骨髓形成血凝块，其中的干细胞分化成软骨细胞，再生成由纤维软骨或类透明软骨构成的替代性组织，但其性能较透明软骨差，术后易复发，且康复的时间长、要求高，被认为是一种过渡手段。该手术对于年轻患者(<45岁)效果较好。目前有将生物材料和其他技术与该手术联合使用。将生物材料作为支架使细胞维持于一定位置，以增强血凝块的早期机械稳定性，或者在钻孔中加入生物活性因子促进透明软骨生成量。但这些技术还存在一些问题尚待解决。④马赛克技术是关节镜下用特制手术器械取非负重区的骨软骨复合体，如镶嵌马赛克一样置于软骨缺损区。这种方法事实上是将低应力区软骨移至高应力区，手术本身也是一种损害，易造成供区软骨的退变。⑤骨膜或软骨膜移植术是利用骨膜或软骨膜生发层(含有丰富的间充质细胞)的成软骨活性将其植入缺损处修复损伤，但仍存在植入物固定不牢、远期效果不确切、移植中的免疫反应等问题。⑥ACI是关节镜下活检取患者自体的软骨，经酶处理后体外提取软骨细胞培养、扩增，然后将软骨细胞以混悬液形式注射到缺损处，取非负重区骨膜或生物膜缝合固定。该术短中期效果肯定，但远期效果观察少，且新生组织多是纤维软骨与透明软骨的混合，机械性能与正常软骨有差异，费用高。⑦MACI，主要是将提取自体活检组织中的软骨细胞进行体外扩增培养后种植在特殊的胶原膜(基质，ACI-MaixTM)上，然后根据缺损形状将MACI膜片剪切后移植与受损处，并用纤维蛋白粘合剂对其密封固定。该方法主要用于15～55岁间由创伤或剥脱性软骨炎所致的软骨缺损。相对而言，手术费用昂贵、病例少、远期疗效不确切。⑧关节原位再生技术是将载有生物趋化因子的生物型支架植入缺损处，诱导内源性多能干细胞迁移聚集于缺损区，并通过控时释放生物因子以刺激体内干细胞增殖分化为软骨细胞，进而重建软骨。原位再生技术采用的支架材料性能是实现软骨有效修复的关键，关于支架如何负载诱导因子并达到缓慢释放，是促进软骨再生支架构建研究中的一大难点[3]。

以上手术方式比较发现，传统治疗多依赖软骨的自主修复，新生的组织多是纤维软骨，其性能较正常软骨差；而组织工程学技术获取的组织虽更接近透明软骨，但又存在体外培养中软骨细胞来源不足的问题，而且软骨细胞属分化终末期细胞，体外培养传代后可能出现“失分化”现象，而逐渐丧失其表型，不再产生软骨特异性的基质成分；关节原位再生技术生成的组织虽然有软骨，但临床报道少。因此，我们应探索软骨修复的新策略，寻找更为理想的种子细胞。而干细胞治疗是组织工程领域软骨损伤修复的研究热点，临床应用前景广阔。

2 BMSCs的来源、特性、优势及分离培养

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)起源于中胚层，终身存在于骨髓、髌骨下脂肪体、骨膜、关节滑膜等结缔组织和器官间质中，负责组织的修复和更新，具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在不同的诱导条件下可以分化成不同的组织，如骨组织、软骨组织、脂肪组织、内皮组织、肌肉组织、神经组织、上皮组织等。MSCs来源广，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，且无免疫排斥[4]。

从骨髓、脐带血、外周血和脂肪组织中均能分离出MSCs。脂肪是MSCs的丰富来源之一[5]，与骨髓来源的MSCs相比成软骨细胞的能力低[6]。外周血分离出MSCs数量很低，很难诱导分化为软骨细胞[7]。有日本学者曾将滑液、骨髓、肌肉及脂肪来源的MSCs移植于兔的软骨缺损之上，以比较不同来源MSCs的活体内成软骨潜能[8]，结果证明，滑液及骨髓来源的MSCs，其成软骨能力要远优于后两种。

BMSCs主要存在于骨髓窦的内腔面，其含量极少，但在体外培养中BMSCs具有较强的增殖传代能力并能保持良好的生物学活性[9]。BMSCs在体内外不仅能逃避宿主的免疫清除，还能调节大多数主要免疫细胞来实现强大的免疫抑制和抗炎功能[10]。由于 BMSCs 的低免疫原性，使其在异体移植时产生的免疫排斥反应较轻微，为它在宿主中的生存提供了可能[11]。

目前，BMSCs的分离方法主要有以下几种：①全骨髓贴壁分离法：将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清培养。②密度梯度离心法。根据骨髓中细胞成分比重的不同，常采用离心分离法进行提取培养。为了提高纯度，目前常常将上述两种方法结合。③细胞表面分子标记分选法[12]。根据BMSCs的细胞表面分子特征进行分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法[13]来进行分选。④红细胞裂解液分离法。⑤特制培养板筛选法。文献报道多采用前2种方法[14]。

3 BMSCs的载体支架、生长因子

软骨组织工程的基本原理是将体外培养的高浓度异体或自体活细胞，种植在天然或人工合成的聚合物支架上，形成细胞支架复合物后，回植入人体或动物的组织缺损部位，同时辅以特殊生长因子。其后支架材料逐渐降解，被细胞分泌的基质所代替，形成某种结构和功能的组织和器官，从而完成修复与再造。成功的软骨组织工程研究包含3部分：①能够分化并保持特殊细胞表型且数量足够的“种子”细胞；②载体支架；③可调节“种子”细胞增殖并维持其表型等特征的生长因子。其中，理想的MSCs载体支架应具备以下几个特点：①能均匀搭载并保留细胞；②便于观察新骨形成；③良好生物降解性；④支持血管快速内生；⑤提高骨的骨传导性桥接；⑥新骨形成后能被吸收和替代利于骨改建；⑦力学强度；⑧可以保留分化细胞的功能；⑨易于加工制作；⑩组织相容性好。常见的天然的支架材料有胶原、纤维蛋白、壳聚糖、藻酸钙、透明质酸和硫酸软骨素等。优点在于取材方便，可降解性，生物相容性好。其中，胶原和纤维蛋白应用最广。

而人工材料则包括聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸聚羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙二醇对苯二酸酯-聚丁烯对苯二酸酯(PEGT-PBT)、聚氨酯、聚乙烯氧化物等。优势是可批量生产，重复性好，形态结构可控性强。但生物相容性不好，且亲水性差，对细胞吸附不足，降解过程代谢产物产生炎性反应[15]。PLA、PGA、PLGA是较常用的多孔生物降解聚合物。PLGA目前应用比较广泛[16]。

应用MSCs的组织工程化软骨主要有种子细胞-支架和种子细胞-支架-细胞因子2种形式。前者是将种子细胞和载体共同培育而获得工程化软骨，支架可维持软骨缺损内的细胞，并作为载体诱导透明软骨细胞。后者是一种完全工程化的组织复合体，它是将种子细胞、载体支架及生长因子重组在一起，然后植入体内而获得新的组织。

BMSCs 的定向分化诱导具有重要作用。诱导方法有：①化学药物诱导。目前较常用，它是在培养体系中加入地塞米松、维生素C及β-甘油磷酸钠。②细胞因子和生长因子的诱导。③在与成骨细胞共培养下分化。④物理方法，如体外冲击波、电磁场等。⑤利用中药如龟甲、杜仲、巴戟天、淫羊藿等的提取物与化学培养液共同或单独发挥作用。⑥在转基因作用下分化。这种诱导包括添加许多不同的生长因子、分化因子、激素和细胞因子。主要有转化生长因子(TGF-β1,TGF-β3)、胰岛素样生长因子( IGF-1)、地塞米松、骨形态发生蛋白家族(BMPs)[17]、软骨来源形态形成蛋白及整合素[18]等。其中，生长因子的影响尤为重要，它们能增强或维持软骨细胞表型的表达，也可激发非软骨细胞表达软骨细胞的表型，在软骨细胞的体外培养研究中均能不同程度地促进软骨的形成[16]。地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素 C是BMSCs向成骨细胞分化和体外成骨的必要条件[19]。

转化因子-β(TGF-β)是当前最强的细胞促生长因子，可以明显促进细胞外基质的合成，增加成骨细胞数量，在软骨细胞定向分化方面起着主要作用；骨形态发生蛋白(BMP)是迄今为止已知的最强的骨诱导形成因子；IGF-1可促进BMSCs向软骨细胞分化，是TGF-β1重要的辅助因子。多个因子的联合应用可更好地修复软骨缺损，但并非所有的生长因子的组合都是有利的[16]。

MSCs可分泌广谱的具有免疫调节[20-21]和/或再生活动性的生物活性分子[22]。通过直接的细胞-细胞相互作用或多种因子的分泌，MSCs修饰局部环境并激活内源性的前体细胞，从而对局部组织修复施以重要影响[23]。用BMSCs移植治疗骨性关节炎机制，可能是通过BMSCs的营养作用和抗炎、抗免疫的特性来影响局部环境和内源性祖细胞从而修复受损的软骨组织[24]。

MSCs结合三维支架和/或生长因子，通过开放性切开术植入动物的软骨缺损处[25-27]具有创伤性并增加感染的风险[28]。因此，一种更为简单、无需支架的方法，即将MSCs制备成为悬液，直接进行关节内注射已被广泛尝试于软骨修复。

4 问题与展望

近年来虽然对BMSCs的研究取得了很大进展，但仍存在一些问题，如：①种子细胞的保存；②新生软骨组织的生物力学性能不甚满意；③缺乏鉴定BMSCs的统一标准，尚未找到BMSCs的特异标记分子；④BMSCs的定向分化机制、影响因素还不甚清楚；⑤干细胞的最佳传递策略，包括：干细胞的给药时间(次数)和传递途径、干细胞给药浓度、干细胞存储介质、干细胞的空间定位[29]；⑥如何提高BMSCs的定向分化率；⑦哪种填充材料作为载体更加有利于BMSCs 发挥作用且不良反应小；⑧现阶段的实验仍是一些初期的动物实验，还需要做高级动物和临床研究[30]；⑨BMSCs实验仅限于自体移植，在异体移植免疫应问题上有待进一步探索[31]；⑩体外扩增、培养细胞的过程可能引入外源性物质，存在安全性问题。

尽管关于BMSCs的应用还有许多问题需要进一步研究，但BMSCs作为未来软骨修复的方向将不容忽视。相信随着研究的深入和应用的推广，一定会将组织工程化软骨更好的应用于临床。

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丁琼浩，E-mail:1163704990@qq.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.04.043

R684.3

A

1008-8849(2015)04-0451-03

2014-03-01