小鼠肝脏细胞分离和原代培养技术研究进展＊

杨 东综述，刘 鑫，郑新川，郑 江△审校

（1.解放军第163医院检验科，湖南长沙410003；2.第三军医大学西南医院综合实验中心，重庆400038）

肝脏是机体主要的消化、代谢器官，同时也是重要的免疫器官；获得肝脏细胞[肝细胞（hepatocytes，HCs）、肝血窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells，LSECs）、肝星形细胞（hepatic stellate cells，HSCs）和枯否细胞（kupffer cells，KCs）等]并进行成功的原代培养，将有助于为研究肝脏的生物学特性（药物代谢、免疫及生理功能等）和“人工肝”工程等提供实验工具和材料；故探索和研究肝脏细胞的分离和原代培养技术具有重要意义。1976年，Seglen首次建立完整的大鼠肝脏原位2步酶灌洗消化技术，而据其方法改良产生了小鼠肝脏细胞的分离和培养技术，并随着分子生物学技术和实验动物学技术的进步，也取得了较大的进展。

小鼠肝脏细胞的分离和原代培养技术主要包括：小鼠肝脏的原位灌洗分离和各型单个细胞制备、肝脏细胞的鉴定和活性测定、各型细胞的培养等，主要涉及肝脏2步灌洗技术、机械消化、酶消化、密度梯度离心、结合荧光抗体标记的流式细胞仪分选、免疫磁珠法、原代细胞培养等技术。

1 小鼠肝脏的原位灌洗分离和各型单个细胞悬液的制备

肝脏的原位灌洗分离技术：大量有活力的肝脏单细胞悬液的获得是原代细胞培养成功的重要保证。1967年，霍华德等首次从小鼠肝脏成功分离出存活的HCs。随着研究的深入，肝脏原位2步灌洗分离和细胞悬液制备方法逐步形成。肝脏原位灌洗通常在小鼠麻醉或脱颈处死后进行，主要分为2步，第1步采用无钙、镁离子的平衡盐溶液（如D-Hank′s平衡溶液、KRB平衡溶液或PBS缓冲溶液等）灌洗，以清除掉肝脏血管内的细胞成分，并去除钙离子依赖性的细胞间连接；第2步采用含钙和胶原酶的平衡盐溶液灌洗，最大程度去除细胞外基质的连接（以观察到肝脏完全变为土黄色，轻触有明显压痕为准）[1-2]。

目前，按灌洗液流经方向，原位灌洗主要分为以下3种方式：经典方式是环形结扎肝前上腔静脉，将灌流液由肝门静脉注入，由肝后腔静脉流出（流经方式同小鼠血流方向）。随着研究的深入，又发展出了另外2种灌流方案：（1）先环形结扎肝后腔静脉，然后快速切开小鼠心包，插入导管经右心房直达下腔静脉，灌流液从心脏下腔静脉流入，由肝门静脉流出。（2）采用逆向灌流法，先环形结扎肝前上腔静脉，导管插入肝后腔静脉，灌流的同时切开肝门静脉，灌流液流经方向为肝后腔静脉流入，肝门静脉流出[1-3]。

各型单个细胞悬液的制备技术：目前，多采用机械解离、酶消化、密度梯度离心、流式细胞仪分离技术和免疫磁珠法相结合的方案[1，3-4]。经原位灌洗的肝脏完整剥离置于含胶原酶的细胞培养基中，机械法剪切为小颗粒组织；培养基中可加入脱氧核糖核酸酶，消化细胞释放出的DNA成分，防止细胞聚团；剪切后组织消化后经100目、100μm和70μm细胞滤器超滤，得到单细胞悬液。基于配体结合原理，有研究者[3，5]对一种广泛存在于HCs表面的受体脱唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）的配体进行生物素化荧光标记，然后结合流式细胞术，快速得到产率高、活力好的HCs；同样，采用流式细胞仪分选的方法也可以获得纯化的HSCs、KCs和LSECs。由于激光照射会对细胞造成损伤，分离过程容易污染，故该方法更适宜于即分即用的情况。由于HSCs与KCs密度接近，用密度梯度离心常不容易把它们分开；Chang等[4]采用了小鼠术前注射静脉脂质体包被的二氯亚甲基二磷酸盐（CL2MDP），大量消除肝脏内的KCs的方法，经常规灌洗、分离和梯度离心后HSCs的产率和纯度有较大改善，且细胞生存率不受影响。

上述方法仅可获得部分细胞亚型，如何一次性分离得到小鼠肝脏的几种主要的细胞（HCs、HSCs、LSECs和KCs），而又不对所得细胞的活力产生较大影响呢？Liu等[1]在研究中引入一种由改良的小鼠肝原位灌洗分离、密度梯度离心与磁珠免疫分离相结合的方法。通过原位灌洗分离结合密度梯度离心分离得到HCs和HSCs，然后分别采用LSECs和KCs表面标志物CD146和F4／80相应抗体标记的免疫磁珠法进行分离，得到高纯度和活力的LSECs[纯度（91.7±2.1）%，活率（94.3±2.1）%]和KCs[纯度（98.3±1.2）%，活率（94.0±2.3）%]。

2 小鼠肝脏细胞的鉴定与活力测定技术

肝脏细胞类型的鉴别一般依赖观察培养中的细胞形态，生物学特性及检测细胞膜标志物等方法进行；而细胞的活率测定一般采用台盼蓝排除实验。根据细胞形态鉴定：HCs体积远大于其他几类细胞，初分离时为立方体样形态，可因后续培养方式的不同呈不同形态变化；在2d培养模式，数天后，呈多边形或不规则形。HSCs经分离后其形态在倒置显微镜下呈球形，折光性强，24h内处于静止状态，可见细胞质内闪光脂滴，培养5d后，细胞由静止状态进入增殖活化状态，呈现星形样伪足，胞质内脂滴浓度逐渐减少，培养14d后，细胞完成活化，胞质内不见脂滴，转化为成纤维样细胞[4]。而KCs细胞分离培养后1～2h在培养基贴壁生长。LSECs在加入促血管内皮细胞生长因子的胶原蛋白预包被培养基中培养则会出现贴壁生长和细胞间的融合。

根据细胞生物学活性和免疫学特征鉴定：成熟巨噬细胞膜可表达独特的表面抗原F4／80，可用于KCs的鉴别及纯度检测[6-8]。此外，ED2抗体是KCs的特异抗体。利用KCs的吞噬碳颗粒特性，观察计算培养基内吞噬有碳颗粒的细胞数也可判断KCs产率。富集维生素A的HSCs具有吞噬凋亡小体的能力，但不能如KCs一样吞噬碳颗粒，故据其细胞特性可对HSCs采用染色方法，如高尔基银染色和脂肪染色等进行区别[4]。LSECs可用CD31抗体[9]进行标记并区分。同时LSECs同血管内皮细胞一样都具有摄取乙酰低密度脂蛋白（acetylated-low density lipoprotein，Dil-Ac-LDL）和体外培养形成血管的能力。在培养基中加入荧光标记的Dil-Ac-LDL，并经荧光显微镜观察计数摄取Dil-Ac-LDL的细胞数可对分离所得LSECs产率进行判断[10]。

3 小鼠肝脏细胞的培养困境及技术发展

HCs培养一直被认为是肝脏原代细胞培养中的难点。研究发现，经深入酶灌洗后HCs脱离了细胞外基质的作用并成为单细胞悬液，自发的细胞凋亡[11-12]就开始加速；“失巢凋亡”现象被认为在HCs的凋亡过程中发挥重要作用[2]；同时，HCs在培养过程中的细胞去分化现象也是自发和渐进的过程[13]。为提高分离细胞在培养中的存活率、降低凋亡率和细胞去分化速度，分离过程控制、培养基成分及培养方案、细胞外基质作用替代方案等成为了细胞培养过程中必须考虑的因素。

3.1 HCs的培养基及主要辅助成分 HCs培养基有：DMEM培养基（dulbecco′s modified eagle′s medium），L-15培养基（leibovitz L-15medium），MEM培养基（minimum essential medium），WE培养基（william′s medium E）和KSFM培养基（keratinocyte-stimulating factor medium）[14]。其中L-15由Kojima最早于1995年提出；不含血清的WE培养基被认为是短期培养（小于10d）的较理想的培养基，可较好地保持HCs的活性，而含血清的WE培养基可被用于数周时间内的HCs培养[5]。含有脑下垂体腺提取物和表皮生长因子的KSFM，被认为可通过阻止肝富集转录因子的丧失来较长时间保持肝细胞的特异基因表达和功能[15]。

培养HCs有时还需要在培养基中加入一些有利于保持HCs表型的辅助成分。如表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF）、HCs生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）和尼克酰胺，可以保留HCs在不同的体外培养基中的增生能力。微量金属离子成分，如铁、铜、锌、锰离子等和微摩级浓度的人工合成糖皮质激素（如地塞米松）、胰岛素、氨基酸、分化因子和胎牛血清等可保持HCs在培养期间更好的分化特性。此外，为提高培养HCs的存活率和促进生长，在细胞外基质中也常加入胶原蛋白、成纤维细胞和胶原蛋白／人工基底膜结合物成分作为培养支持物[2，14，16]。

3.2 HCs的培养技术[2，5，13，16-20]

3.2.1 2D培养技术 2D培养技术是一种短期的HCs培养技术，方法为将HCs直接接种于单层胶原蛋白包被的培养基上。在这种条件下培养，HCs可以分泌出清蛋白和尿素，但却只能展示出极小量的细胞色素P450活性，而这种培养方式只能维持短期的培养，第1周HCs就会很快失去一些特殊的生物学功能。

3.2.2 3D培养技术

3.2.2.1 三明治夹心法 1989年，Dunn等提出了三明治夹心法培养HCs的技术。方法为：细胞接种于胶原蛋白层之间，培养形成广泛的微管网络结构，并可保证局部的Ntcp表达循环和维持5d时间的转运活力。在鼠HCs三明治夹心法培养模型中，HCs的立方体形态可保持达42d，分离培养1周内主要的酶和复合物活性仍保持较好，可见细胞间形成E-钙黏蛋白和胆小管，但不表达表皮细胞受体，如EGF-R和LDL-R。

3.2.2.2 人工基底膜构建的球状HCs培养支持物 将HCs接种在人工基底膜构建的球状HCs培养支持物，其形成的HCs形态为球形，并非肝组织中HCs的立方体形。培养中，主要的酶和复合物活性在分离培养1周内仍保持较好，HCs表达E-钙黏蛋白，并形成广泛的胆小管，细胞间接触面的内皮细胞表面标志物得到了保留。

3.2.2.3 同LSECs的共培养技术 HCs同LSECs一起培养，可保留HCs大部分的极性标志物，并在HCs与LSECs接触面之间表达高水平的内皮细胞受体，如EGF-R和LDL-R，并可因部分的细胞接触，HCs生长受到生成因子的介导。

3.2.2.4 同3T3纤维原细胞的共培养技术 Bhatia等提出了将HCs同3T3-J2鼠纤维原细胞的一起培养的技术，培养中观察到可形成独特的细胞集落，细胞间的接触表现为连接蛋白-32和胆小管，但不表达EGF-R和LDL-R。

3.3 流体培养技术 流体培养技术是基于模仿体内HCs生长环境而构建的一种培养技术。激素、营养素及氧成梯度通过漂浮的生物反应器，并被培养中的细胞摄取；这种梯度可使培养细胞呈现新陈代谢的成带现象，同时可加速物质的传输速度，观察到更高的药物代谢水平。

3.4 接种密度与氧供 HCs氧代谢旺盛，而培养中HCs的活力和耗氧量跟氧供水平及细胞外基质有关。Lorenna等研究发现，小鼠HCs在补充了人工基底膜作为细胞外基质的培养基中培养时，接种细胞密度、氧供水平、培养基深度等因素都会影响培养细胞表面的氧浓度，而人工基底膜结合氧浓度调节可较好维持培养HCs产生清蛋白的水平和功能。

3.5 LSECs、KCs和HSCs的培养 LSECs在肝脏脂代谢、细胞分化、免疫、炎性等反应中发挥重要作用。其培养可使用EGM2mv培养基，也可加入5ng／mL的VEGF后与HCs共培养[5]。KCs被认为是定植于肝脏的吞噬细胞。在培养中，KCs不易快速活化、增殖；对KCs的培养可用含10%胎牛血清的DMEM培养基进行[21]。HSCs是主要的肝脏基质细胞，在肝的再生、分化和炎性反应中发挥重要作用。培养中的HSCs可快速活化并增殖，可使用含10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养[21-22]。

4 无菌培养控制和提高细胞收益的方案

4.1 无菌控制 为保证获得没有细菌污染的初分离细胞悬液，肝脏的原位2步酶灌洗应该在可控温的无菌安全柜中进行。采用的灌洗用具，如泵管、18G或22G针头、灌洗缓冲液等都应当无菌。获取细胞在首次培养的培养基中还可加入一定浓度的抗菌素，如（100units青霉素＋100μg链霉素）／mL等[5]。

4.2 收益提高 首先，肝脏的原位灌洗应做好时间的统筹安排。由于HCs有氧代谢旺盛，为降低手术中HCs氧代谢水平，肝脏原位灌洗手术可采用将手术平板置于冰水混合物上进行。实验使用的灌洗缓冲液及酶消化液应提前预温到37℃，而细胞离心时应控制在4℃。其次，由于钙离子在灌洗过程中起双重作用，对钙离子控制是肝脏原位灌洗阶段应该被重视的环节。因此，2步法所用的缓冲液不可混用；胶原酶的浓度和活性直接关系到HCs的分离效率，也应进行相应控制。再次，灌注液pH应控制在7.4，因此，需采用较强的缓冲体系如添加有机缓冲物羟乙基哌嗪乙硫磺酸[4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethane sulfonic acid，HEPES]等方法。此外，灌流速度、合适的密度梯度离心液和离心速度等也是应特别注意的因素。

5 展望

小鼠肝脏细胞分离及培养技术的建立和发展为人类快速、有效获取肝脏细胞作为研究对象提供了可能；特别是建立和完善HCs的可靠、长期培养技术将为人类人工生物肝脏研究和临床应用提供参考技术，具有重要意义。

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