产蛋前期和产蛋期鹅HPG轴OAZ1和OAZ2基因表达的研究

马 容，康 波，姜冬梅，何 珲

(四川农业大学 动物科技学院，四川 雅安 625014)

产蛋前期和产蛋期鹅HPG轴OAZ1和OAZ2基因表达的研究

马 容，康 波，姜冬梅，何 珲

(四川农业大学 动物科技学院，四川 雅安 625014)

【目的】 探讨产蛋前期和产蛋期鹅HPG轴中OAZ1和OAZ2基因表达的差异。【方法】 选取健康的产蛋前期和产蛋期四川白鹅母鹅各3只，采集下丘脑、垂体和卵巢组织样品，提取总RNA并反转录合成cDNA，应用实时荧光定量PCR检测产蛋前期和产蛋期四川白鹅下丘脑、垂体、卵巢组织中OAZ1和OAZ2基因的相对表达量。【结果】 在产蛋前期和产蛋期四川白鹅下丘脑、垂体和卵巢组织中，OAZ1和OAZ2基因均有表达，并且产蛋期OAZ1和OAZ2表达量均极显著高于产蛋前期(P<0.01)，产蛋期四川白鹅下丘脑、垂体和卵巢中OAZ1的表达量分别是产蛋前期的1.79倍(P<0.01)、2.96倍(P<0.01)和3.48倍(P<0.01)；产蛋期四川白鹅下丘脑、垂体和卵巢中OAZ2的表达量分别是产蛋前期的2.66倍(P<0.01)、1.38倍(P<0.01)和2.03倍(P<0.01)。【结论】OAZ1和OAZ2可在HPG轴的各级水平发挥其调控鹅繁殖过程的功能，OAZ1主要参与卵巢功能的调控，而OAZ2主要参与下丘脑功能的调控。

四川白鹅；鸟氨酸脱羧酶抗酶1(OAZ1)；鸟氨酸脱羧酶抗酶2(OAZ2)；多胺；下丘脑-垂体-性腺轴；实时荧光定量PCR

多胺作为广泛存在于动物机体中的一类低分子脂肪族阳离子化合物，在细胞周期、基因表达、胚胎发育、细胞生长和分化中起着至关重要的作用[1-2]。鸟氨酸脱羧酶(Ornithine decarboxylase,ODC)是多胺生物合成途径的关键限速酶，对维持细胞内多胺水平的稳定有重要作用，其活性可在转录、翻译和翻译后被精确调控[3]。鸟氨酸脱羧酶抗酶(Ornithine decarboxylase antizyme,OAZ)是多胺诱导的一种能负调控细胞多胺水平的蛋白酶[4]。研究表明，目前已发现的OAZ家族共包括4个成员，即OAZ1、OAZ2、OAZ3和OAZ4。OAZ1作为OAZ家族中最早被发现的成员，是目前研究最为广泛的鸟氨酸脱羧酶抗酶。研究发现，OAZ1可与ODC结合并介导26S蛋白酶体降解ODC，从而负调控细胞内的多胺水平[5]。OAZ1还可以调节细胞周期，影响细胞凋亡；此外，OAZ1还具有抗肿瘤效应[6]。近年来的研究表明，OAZ1还可参与动物繁殖的调节，An等[7]研究发现，多胎(3羔)奶山羊卵巢组织中OAZ1基因的表达量显著高于单胎奶山羊，提示OAZ1可能促进奶山羊的卵泡发育和排卵。而在家禽方面，Kang等[8]研究表明，产蛋期籽鹅卵巢组织中OAZ1表达量显著高于产蛋前期，提示OAZ1可能参与鹅产蛋过程的调节。目前，关于OAZ1调节细胞周期和抗肿瘤方面的研究很多，而关于OAZ1调节机体多胺水平，进而调节动物繁殖方面的研究甚少，尤其是OAZ1对鹅繁殖方面的调控机制尚不清楚。OAZ2与OAZ1的结构和组织分布相似，但表达量相对较少。在体外，OAZ2不能促使蛋白酶体降解ODC，但仍能抑制ODC活性和多胺的摄取；在体内，OAZ2不仅能促使蛋白酶体降解ODC，也能抑制ODC活性及动物对多胺的摄取[9]。总之，OAZ2也可通过降低ODC活性从而降低多胺的水平[10]。刘梦瑶等[11]研究表明，在B16-F1细胞中高表达OAZ2将使细胞阻滞于G0/G1期，说明OAZ2也能调节细胞周期。然而，OAZ2是否也具有调节动物繁殖功能的作用尚不清楚。动物生殖系统的发育和功能的维持受到下丘脑-垂体-性腺轴(Hypothalamic-pituitary-gonadal axis,HPG)的调控。因此，本研究定量检测四川白鹅产蛋前期和产蛋期下丘脑、垂体、卵巢组织中OAZ1和OAZ2基因的表达量，旨在阐明OAZ1和OAZ2在四川白鹅不同繁殖阶段HPG轴的表达差异，为探明OAZ1和OAZ2基因功能和提高鹅产蛋性能的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

选取健康的产蛋前期和产蛋期四川白鹅母鹅各3只，采集下丘脑、垂体和卵巢组织样品，液氮冷冻后，置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2 引物的设计及合成

根据四川农业大学动物生理实验室克隆获得的OAZ1和OAZ2编码区序列，应用Oligo 6.0和Primer 5.0设计OAZ1和OAZ2基因特异性引物；同时根据NCBI中原鸡和火鸡的编码区序列设计内参基因β-actin的引物。引物由上海生工合成，其序列信息见表1。

1.3 总RNA提取及cDNA的合成

根据Trizol试剂盒的操作说明，提取四川白鹅产蛋前期和产蛋期各组织样品的总RNA。取5 μL总RNA样品，用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量。参照M-MLV first strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen)说明书反转录合成cDNA 第一链。反转录体系为20 μL，先将总RNA 5 μL、 1 μL Oligo (dT)18(500 μg/mL)、1 μL dNTP混合物(10 mmol/L)、灭菌去离子水5 μL于70 ℃反应5 min，然后迅速置于冰上2 min；再加入4 μL的5×Buffer、1 μL的RNasin(40 U/μL)和2 μL的DTT(0.1 mol/L)混匀，37 ℃ 2 min，之后加入1 μL的M-MLV(200 U/μL)混匀，37 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min，然后终止反应，将获得的cDNA模板保存于-20 ℃冰箱中。

1.4 目的片段的PCR扩增

以合成的cDNA为模板进行PCR扩增，总体积20 μL，灭菌去离子水8.0 μL，上游引物(10 μmol/L)0.5 μL，下游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，cDNA模板(50 ng/μL)1.0 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)10.0 μL。PCR 反应程序为：94 ℃变性5 min；95 ℃变性10 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环。反应结束后，取5 μL PCR产物用于电泳检测，确认PCR反应产物大小与目的片段是否一致。

1.5 OAZ1和OAZ2表达量的实时荧光定量PCR检测

实时荧光定量PCR的反应体系为50 μL：模板cDNA 1 μL，SYBR®Premix Ex TaqTM(2×)25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，RNase Free水补充至50 μL。循环参数为：94 ℃预变性10 s；94 ℃变性5 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s(采集荧光信号)，45个循环，并绘制溶解曲线。每个样品进行3次重复，用β-actin作为内参基因，采用2-ΔΔCt法处理数据，计算产蛋前期和产蛋期四川白鹅下丘脑、垂体、卵巢组织OAZ1和OAZ2的相对表达量。

1.6 数据分析

应用SAS 9.2统计分析软件中的MEANS程序进行描述性统计分析，用ANOVA程序进行方差分析和Duncan’s多重比较。OAZ1和OAZ2的相对表达量结果用“平均值±标准差 (Mean±SD)”表示。

2 结果与分析

2.1 四川白鹅总RNA提取及目的基因的PCR扩增

图1显示，四川白鹅卵巢总RNA的28S和18S rRNA条带清晰，并且28S和18S rRNA的条带亮度比值为(1～2)∶1。下丘脑和垂体组织总RNA质量与卵巢一致(图略)。图2显示，以卵巢cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳获得了β-actin(222 bp)、OAZ1(142 bp)、OAZ2(142 bp)的基因片段，扩增片段的长度与预期结果一致，而且特异性较好。下丘脑和垂体组织的PCR结果与卵巢一致(图略)。结果表明，试验合成的不同组织的cDNA可以用于后续的实时荧光定量PCR检测。

图1 四川白鹅卵巢总RNA
Fig.1 Total RNA in ovary of Sichuan white goose

图2 四川白鹅卵巢组织β-actin、OAZ1和OAZ2基因的PCR扩增结果Marker.DL 2000 DNA Marker
Fig.2 PCR amplification ofOAZ1,OAZ2 andβ-actingenes in ovary of Sichuan white goose

2.2 四川白鹅HPG轴中OAZ1和OAZ2基因的相对表达量

图3显示，产蛋期四川白鹅下丘脑、垂体和卵巢组织中OAZ1和OAZ2表达量均极显著高于产蛋前期(P<0.01)，分别是产蛋前期的1.79和2.66倍；2.96和1.38倍；3.48和2.03倍。

3 讨 论

动物繁殖涉及细胞迁移、增殖、分化和死亡等过程。多胺广泛存在于动物机体中，参与细胞生长和分化的调节。Pietila等[12]研究表明，适宜浓度的多胺可以促进小鼠卵泡发育，而多胺过量将抑制卵泡的发育。多胺可通过与动物体内的多种生殖激素作用，从而参与动物繁殖功能的调节[13]。本研究发现，产蛋期四川白鹅下丘脑OAZ1和OAZ2的表达量极显著高于产蛋前期，提示OAZ1和OAZ2可能通过抑制ODC活性，降低下丘脑中多胺的生物合成，进而参与四川白鹅繁殖功能的调节。研究表明，由卵巢分泌的雌激素需通过其受体的介导，从而发挥其调节基因表达的功能，而雌激素受体在包括下丘脑在内的脑内分布广泛[14]。天然多胺可以促进雌激素受体和雌激素应答元件之间的识别[13]。故笔者推测下丘脑中高水平表达的OAZ1和OAZ2可降低多胺的合成，从而影响雌激素及其应答元件之间的识别，进而参与调控四川白鹅的繁殖功能。

促性腺激素(促黄体生成素和促卵泡激素)对卵泡发育及排卵有重要的调控作用。在大鼠卵巢中，促性腺激素可诱导ODC的活性[15]。在猪的卵泡颗粒细胞中，促性腺激素能通过cAMP上调ODC水平[16]。本研究结果表明，产蛋期四川白鹅垂体组织中OAZ1和OAZ2的表达量均极显著高于产蛋前期，提示OAZ1和OAZ2可在垂体通过调节HPG途径参与调控四川白鹅的繁殖功能，其可能的机制是：高水平的OAZ1和OAZ2均能抑制ODC活性，从而使体内多胺水平降低，影响垂体促性腺激素的分泌，进而调控四川白鹅的繁殖功能。

研究表明，处于发育时期的大鼠卵巢中ODC维持着较高的生物活性[17]。Bastida等[18]研究发现，促黄体生成素和人绒毛膜促性腺激素可提高雌鼠窦状卵泡颗粒细胞中的ODC活性，表明ODC对动物卵泡发育具有调控作用。本研究结果显示，OAZ1和OAZ2在产蛋期四川白鹅的卵巢组织中的表达量极显著高于产蛋前期，这与Kang等[8]的研究结果相似，推测产蛋期卵巢组织中高表达的OAZ1和OAZ2可能抑制了ODC的活性，从而抑制多胺的生物合成，进而影响四川白鹅卵泡细胞的发育，提示OAZ1和OAZ2在产蛋期四川白鹅卵巢组织中的高水平表达可能与鹅的产蛋性能有关。宿甲子等[19]研究也表明，籽鹅产蛋期卵巢中OAZ1基因mRNA的相对表达量显著高于产蛋前期，提示本研究中OAZ1可能通过调控卵泡的发育来影响四川白鹅的繁殖功能。另有研究表明，骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMPs)能够调控雌性哺乳动物的生殖能力，尤其是参与哺乳动物卵泡发生[20]。BMPs的作用可以被靶细胞中的下游信号分子Smad6抑制[21]。Ku等[22]研究表明，Smad6的转录激活需要OAZ作为辅因子，OAZ通过与Smad1/4形成复合物从而激活Smad6的转录，最终抑制BMPs通路。由此推测，在四川白鹅产蛋期卵巢中，高水平表达的OAZ1和OAZ2可能通过激活Smad6的转录，从而抑制BMPs通路，最终调控鹅卵泡的发育，影响四川白鹅的繁殖功能。

4 结 论

四川白鹅下丘脑、垂体、卵巢中均表达OAZ1和OAZ2，并且产蛋期下丘脑、垂体、卵巢组织中OAZ1和OAZ2的表达量均极显著高于产蛋前期，说明OAZ1和OAZ2可在HPG轴的各级水平参与动物繁殖功能的调节，OAZ1主要参与卵巢功能的调控，而OAZ2主要参与下丘脑功能的调控。

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Expressions ofOAZ1 andOAZ2 genes in HPG axis of goose at pre-laying and laying stages

MA Rong,KANG Bo,JIANG Dong-mei,HE Hui

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an,Sichuan625014,China)

【Objective】 This study aimed to explore the differences in expressions of ornithine decarboxylase antizyme 1 (OAZ1) and ornithine decarboxylase antizyme 2 (OAZ2) genes in the hypothalamic-pituitary-gonadal axis of Sichuan white geese at pre-laying and laying stages.【Method】 Healthy female Sichuan white geese at pre-laying and laying stages (n=3,respectively) were selected,and hypothalamic,pituitary and ovary tissues were collected.Total RNA was extracted and cDNA was synthesized.The expression levels ofOAZ1 andOAZ2 in hypothalamus,pituitary gland and ovary samples were determined by quantitative real-time PCR.【Result】OAZ1 andOAZ2 genes expressed in hypothalamus,pituitary and ovarian tissues of Sichuan white goose at both pre-laying and laying stages, and the expressions ofOAZ1 andOAZ2 at laying period were significantly higher than at pre-laying period (P<0.01).The expression levels ofOAZ1 mRNA in hypothalamus,pituitary and ovarian tissues of geese at laying stage were 1.79 (P<0.01),2.96 (P<0.01) and 3.48 (P<0.01) times of those for geese at pre-laying stage,respectively.The levels ofOAZ2 mRNA expression in hypothalamus,pituitary and ovarian tissue of geese at laying stage were 2.66 (P<0.01),1.38 (P<0.01) and 2.03 (P<0.01) times of those in geese at pre-laying stage,respectively.【Conclusion】OAZ1 andOAZ2 mediated the biological function of HPG axis.OAZ1 may play a more important role in ovary whileOAZ2 may play a more important role in hypothalamic.

Sichuan white goose;ornithine decarboxylase antizyme 1 (OAZ1);ornithine decarboxylase antizyme 2 (OAZ2);polyamines;hypothalamic-pituitary-gonadal axis;quantitative real-time PCR

2013-09-29

国家自然科学基金项目(31201798)；高等学校博士学科点专项科研基金项目(20105103120003)

马 容(1990-)，女，四川内江人，在读硕士，主要从事动物卵泡发育机理研究。E-mail:marong53@sina.com

姜冬梅(1978-)，女，黑龙江海林人，实验师，主要从事环境生理研究。E-mail:jiangdm9277@163.com

时间:2015-01-05 08:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.02.033

S835;Q786

A

1671-9387(2015)02-0044-05

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150105.0859.033.html