脑衰反应调节蛋白-2在细胞迁移和非神经系统相关疾病中的研究

作者单位： 510080 广州，中山大学附属第一医院妇产科

脑衰反应调节蛋白-2在细胞迁移和非神经系统相关疾病中的研究

范莉陈淑琴

【摘要】脑衰反应调节蛋白-2(CRMP-2)是一种多功能调节蛋白，它不仅在哺乳类动物的神经系统内高度表达，而且在T细胞、肿瘤细胞和正常上皮细胞等非神经系统的细胞和组织中存在表达。在神经系统中，CRMP-2在促进神经轴突生长、维持神经细胞极性、神经元迁移等方面均起着重要作用。在非神经系统中，CRMP-2正向调节T细胞骨架重组和细胞迁移，负向调节肿瘤细胞的迁移水平，并以磷酸化形式参与肿瘤细胞增殖，被认为可能成为某些恶性肿瘤的生物标志物和治疗靶点。

【关键词】脑衰反应调节蛋白-2；轴突生长;细胞迁移；肿瘤；子宫内膜异位症

DOI：10.3969/g.issn.0253-9802.2015.03.002

通讯作者，陈淑琴, E-mail:chenshuqin1021@163.com

收稿日期：(2014-09-18)

Study of CRMP-2 in cell migration and non-nervous system-related diseasesFanLi,ChenShuqin.DepartmentofObstetricsandGynecology,theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China

Correspondingauthor,ChenShuqin，E-mail:chenshuqin1021@163.com

Abstract【】Collapsin response mediator protein-2(CRMP-2) is a multi-functional regulator protein. CRMP-2 is not only highly expressed in the mammalian nervous system, but also in non-neuronal cells and tissues, such as T lymphocytes, tumor cells and normal epithelial cells. In the nervous system, CRMP-2 plays an important role in promoting the outgrowth of neural axon, maintaining neural cell polarity and neuron migration. In the non-neuronal system, CRMP-2 positively regulates the cytoskeletal arrangement and cell migration of T lymphocytes, negatively interferes the cell migration of tumor cells and participates in tumor cell proliferation via phosphorylation. CRMP-2 is considered as a biomarker and therapeutic target of certain malignant tumors.

【Key words】Collapsin response mediator proteins-2; Axon outgrowth; Cell migration; Tumor;

Endometriosis

脑衰反应调节蛋白家族(CRMPs)是神经系统内高度表达的细胞质磷蛋白，包括5个家族成员(CRMP-1~5)[1]。1995年Goshima等在研究导向蛋白3 A(Sema3A)诱导轴突生长崩溃通路中发现CRMP-2[2]。研究表明，CRMP-2是该信号转导通路的细胞内成分，参与调节轴突生长锥崩溃，其主要作用机制是通过参与Sema3A信号通路和溶血磷脂酸信号通路，改变CRMP-2的磷酸化状态，使CRMP-2与微管蛋白之间的相互作用发生改变，从而影响神经细胞的轴突生长[1-4]。因此，CRMP-2在神经细胞的轴突生长过程中起着重要的作用。研究同时发现，CRMP-2还能影响脑皮质的形成，主要与其影响大脑皮质中的神经元迁移有关[5]。另外，CRMP-2被证实在其他多种非神经细胞中表达并影响细胞的迁移功能[6-7]。在其他系统疾病的组织中其表达水平也存在异常改变[8-11]。因此，有学者认为CRMP-2可能成为非神经系统疾病的生物标志物。本文就CRMP-2在细胞迁移功能和非神经系统相关疾病中的研究作一综述。

一、 CRMP-2与细胞迁移

1. CRMP-2与神经细胞迁移

研究表明，CRMP-2蛋白在小鼠的大脑皮质层组织中呈现高表达，当敲除CRMP-2基因时，可阻止神经元从脑室区迁移至大脑皮层的各层所必须的多极向双极转化过程，从而扰乱皮质层神经元的放射状迁移，导致神经元在小鼠新大脑皮层的中间区聚集[5]。这一过程是通过CRMP-2和α2-嵌合蛋白间的相互作用调节CRMP-2的精细活动和定位，促进双极形成和稳定。反之，CRMP-2还可以通过典型的骨形态发生蛋白(BMP)信号通路抑制神经元迁移，BMP是转化生长因子超家族中的一员，其作为神经中枢起源分化的调节者，通过与转录因子SMAD1的相互作用抑制CRMP-2在新大脑皮层中的转录和表达，从而导致多极神经细胞的积聚，影响神经细胞的定向迁移[12]。

因此，CRMP-2是大脑皮质发育的关键调节因素之一，在大脑皮质形成中也起着重要的作用，这是通过CRMP-2调节神经细胞的生物学行为，尤其是细胞迁移来实现的。

2. CRMP-2与非神经细胞的迁移

CRMP-2除了在神经元中存在表达，还被证实在多种非神经细胞中存在。Vincent等[6]首次证实，CRMP-2几乎存在于所有的外周血单核细胞，特别是T细胞中。研究证实，CRMP-2主要存在于T细胞的细胞质中，它可与细胞骨架微管蛋白和T细胞柔性结构尾足中重新分配的波形蛋白相结合。当RNA介导的CRMP-2基因沉默时，可明显降低T细胞的两极分化(尾足形成)和迁移率；当CRMP-2基因过度表达时，可促进转染的淋巴细胞尾足形成和迁移。

进一步的研究表明，CRMP-2的磷酸化在细胞骨架重组、调节T细胞迁移的过程中起着重要作用。一方面，T细胞中的趋化因子——间质细胞来源因子-1α(SDF1/CXCL12)与其同源受体CXCR4结合可激活包括异源三聚体G蛋白、酪氨酸激酶的Src家族和磷酸肌醇3-激酶(PI3K)的尾足-信号通路，导致CRMP-2在T细胞的尾足中重新定位，使T细胞极化[13-14]。另一方面，CXCL12能使CRMP-2基因序列中的Thr509/514磷酸化减少，使CRMP-2的Thr479位点的磷酸化增加，从而加强CRMP-2和细胞骨架之间的连接，增加淋巴细胞的迁移率[14]。

该研究团队还发现，逆转录人淋巴系白血病病毒-1(HTLV-1)可以影响CRMP-2的活性，导致T细胞增高的迁移潜能，主要是通过调节CRMP-2的磷酸化、裂解和激活T细胞的PI3K/Akt/GSK3/ CRMP-2轴，从而正向调节细胞骨架重组和淋巴细胞迁移[15-16]。

研究证实，CRMP-2在恶性肿瘤细胞和正常上皮细胞中均有表达，且能影响细胞的迁移功能。有研究发现，CRMP-2在乳腺癌和结肠癌的细胞株、以及纤维母细胞和上皮细胞中均有表达[7]。有学者利用短发夹RNA(shRNA)干扰直肠癌细胞株SW480中的CRMP-2表达，发现当CRMP-2蛋白的表达水平降低时，Rho相关激酶Ⅱ(ROCKⅡ)的平均活性增强25%，细胞迁移水平明显增加；当使用ROCKⅡ抑制剂干预敲除CRMP-2基因的SW480细胞时，细胞迁移水平明显下降。据此认为，CRMP-2通过ROCKⅡ活性依赖的途径调节SW480细胞的趋触性迁移。同样，在与上述同样的非恶性肿瘤的上皮细胞实验中也得出同样的结论。该研究还利用小干扰RNA(siRNA)干扰人乳腺癌细胞中CRMP-2的基因表达，发现当干扰总体CRMP-2或CRMP-2的长亚型CRMP-2L的基因表达时，均可使细胞的局部黏附和应力纤维数目增加；在使用ROCKⅡ抑制剂时上述作用消失。因此，敲除CRMP-2基因可增加ROCKⅡ依赖的肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化，伴随着突起皮层肌动蛋白细胞骨架和黏附结构的形成，调节肌动蛋白细胞骨架的收缩。该研究还发现，ROCKⅡ能与CRMP-2L特异性结合，并抑制ROCKⅡ的活性。另外，利用结肠癌淋巴结转移来源的细胞株SW620作为研究载体时发现，异位表达的CRMP-2L可使肿瘤细胞趋触性迁移水平降低，而ROCKⅡ抑制剂可降低SW620细胞的迁移。除此之外，单独表达CRMP-2L和ROCKⅡ的结合区域多肽同样能降低肿瘤细胞的迁移水平。因此，CRMP-2L作为ROCKⅡ的选择性抑制剂，通过其N-端与ROCKⅡ的催化区域结合，抑制ROCKⅡ的活性，影响其介导的细胞内基质聚集的功能，从而影响肿瘤细胞的迁移，达到影响肿瘤的发生、发展的目的[17]。另有研究发现，在结肠癌细胞中，CRMP-2L的磷酸化水平升高可降低CRMP-2L对ROCKⅡ依赖的细胞迁移和侵蚀能力的抑制作用，而糖原合成激酶3(GSK3)可使CRMP-2发生磷酸化，导致CRMP-2与ROCKⅡ的结合减少，抑制结肠癌细胞的迁移和侵蚀[18]。因此，CRMP-2通过与ROCKⅡ的催化区域相互作用，以及GSK3对CRMP-2的磷酸化，影响其与ROCKⅡ的结合，实现对ROCKⅡ功能的调节。

CRMP-2可以影响神经及非神经细胞的迁移功能，并有可能通过激活不同的信号通路以及作用方式改变磷酸化状态，从而达到增强或抑制细胞的迁移能力，甚至导致疾病的发生，其中，CRMP-2磷酸化后的功能改变以及影响磷酸化的各级因子需要得到更多的关注。

二、 CRMP-2在非神经系统相关疾病中的研究

1. CRMP-2与恶性肿瘤

目前，关于CRMP-2与恶性肿瘤的关系研究较多。业已证实，在多种恶性肿瘤组织中均能检测到CRMP-2的表达。Wu等[11]对来源于12种类型结直肠癌的21个细胞株进行了蛋白组学分析，发现在所有结直肠癌细胞株中均可检测到CRMP-2的表达。他们还对43例结肠癌患者的正常结肠和癌组织以及正常人群结肠组织进行PCR检测，发现均有CRMP-2 mRNA表达，且癌组织中CRMP-2 mRNA表达水平明显高于结肠癌患者正常结肠组织和正常人群的结肠组织。同时，该研究通过免疫组织化学染色法检测了169例结直肠癌组织切片中CRMP-2的表达情况，发现CRMP-2主要定位于肿瘤细胞的细胞质中，58.6%的癌组织CRMP-2染色阳性，仅有10%的癌旁非肿瘤组织中呈阳性。此外，早期结肠癌患者癌组织和淋巴转移组织中的CRMP-2阳性率明显高于晚期结直肠癌患者。但CRMP-2的表达水平与淋巴结转移、肿瘤分期和5年生存率无关。上述研究结果表明，CRMP-2可作为结直肠癌的生物学标志物之一，但不能作为一个独立的预后指标。

Oliemuller等[9]检测了91例非小细胞肺癌患者癌组织和正常肺组织中CRMP-2的表达情况，发现2种组织的细胞质中均有表达CRMP-2，但肺癌组织中CRMP-2表达水平明显高于正常组织。研究仅在肺癌细胞中检测到磷酸化的CRMP-2(Thr-514)，其主要集中在细胞核内。CRMP-2表达强度与非小细胞肺癌患者的总生存率或无复发生存率等临床结局之间无关。在没有接受过辅助治疗的患者中，Thr-514表达水平与总体生存率呈负相关。这表明，CRMP-2磷酸化水平可作为小细胞肺癌的预后指标之一。Oliemuller等还对可能的机制进行了一系列研究，结果发现非磷酸化的CRMP-2可以增强微管的稳定性，参与细胞分裂的进程。反之，CRMP-2的磷酸化使CRMP-2与微管蛋白的结合受到破坏，延迟纺锤体的聚集。此外，磷酸化缺陷的CRMP-2变异体可以增加细胞中P53和P21的表达，从而诱导细胞凋亡，提示CRMP-2以磷酸化的方式参与了细胞的有丝分裂，存在磷酸化的CRMP-2表达是细胞具有高增殖能力的特征。因此，CRMP-2可能成为非小细胞肺癌有效的治疗靶点。

Shimada等[10]研究了CRMP-2在乳腺癌组织中的表达，发现乳腺癌患者肿瘤组织中的CRMP-2表达水平和mRNA表达水平均明显低于正常乳腺组织中的表达水平，但其他CRMP家族成员的表达水平却无差异。同时发现，CRMP-2的表达水平与肿瘤的组织形态、直径、组织学分期、淋巴结转移、淋巴或血管浸润和肿瘤分期等临床特征均无关。与肺癌相似，Thr-514仅在癌组织的细胞中表达，主要位于细胞核中，且组织学分期高的乳腺癌组织中Thr-514表达水平明显高于组织学分期低者。进一步研究发现，Cdk5和GSK-3β催化位于乳腺上皮细胞核内的磷酸化CRMP-2可能促进了乳腺癌的发展。

2. CRMP-2与非恶性肿瘤

关于CRMP-2与非恶性肿瘤的关系研究较少。Hwang等[8]发现了CRMP-2在子宫内膜异位症中存在异常表达。该研究采集了子宫内膜异位症患者和正常女性经血中的内膜组织，利用二维电泳蛋白组学，发现有3种蛋白(CRMP-2，UCH-1和MYL9)在子宫内膜异位症患者内膜组织中的表达较正常子宫内膜组织中的表达降低3倍或以上，然而经蛋白印迹法证实，仅子宫内膜异位症患者内膜组织中CRMP-2的表达水平较正常女性子宫内膜组织中的表达水平降低2.5倍，其差异有统计学意义。由此推测，CRMP-2可能在子宫内膜异位症的发生和发展过程中起着一定的作用，而且有可能成为子宫内膜异位症的生物学标志物之一。

子宫内膜异位症虽然是一种妇科良性疾病，但却具有恶性肿瘤的生物学特征，如细胞增殖、迁移、侵袭等方面的改变[19]。CRMP-2在上述恶性肿瘤和子宫内膜异位症中均存在异常表达，那么，CRMP-2是如何参与这些疾病的发生、发展过程？它与恶性肿瘤和子宫内膜异位症的分期等临床指标等关系如何？参与了哪一个环节？是否通过影响细胞迁移功能参与其中？影响机制如何？这些都需要进一步的研究证实，而CRMP-2在细胞迁移功能中的作用可以为日后的研究提供线索。

三、结语

随着CRMP-2研究的逐步开展，研究发现CRMP-2不仅在神经细胞和组织中表达，也表达于非神经细胞中。CRMP-2表达水平和磷酸化状态的异常改变可导致神经细胞和多种非神经细胞的迁移功能发生改变，参与多种相关疾病的发生和发展过程，其机制尚有待进一步的深入研究。

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(本文编辑：林燕薇)

基础研究论著