干细胞治疗技术研究与实践

潘兴华，庞荣清，蔡学敏，阮光萍，朱光旭，杨建勇

干细胞治疗技术研究与实践

潘兴华，庞荣清，蔡学敏，阮光萍，朱光旭，杨建勇

干细胞；治疗；技术；实践

利用干细胞(stem cell,SC)的自我更新和多向分化特性来治疗损伤、退变性疾病是医学发展的新方向。SC可来源于早期胚胎和成体组织，还可通过体细胞核移植、基因导入及生物活性因子诱导等方式获得[1]。不同来源的干细胞具有共同的生物特性，但在分化潜能上有一定差异。胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)具有强大的可塑性，但涉及临床应用尚存在伦理、安全及技术问题。人工诱导获得的诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)具有ESC的基本特性，应用前景最好，但还有诸多技术问题需要解决。与之相比，来源于成体组织的干细胞(adult stem cell，ASC)分化潜能相对有限，但可以实现个体化治疗，避免ESC的弊端，具有临床应用优势。来源于骨髓、脐带等组织的间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)具有跨胚层分化潜能，体外生长速度快，易于大规模和标准化生产，其优势是免疫原性低，异体移植治疗无明显排斥反应，可能在临床优先应用[2]。SC治疗具有多重生物效应，对战创伤、衰老退变、细胞变性坏死及自身免疫等疾病治疗具有药物难以替代的作用。

1 干细胞治疗技术研究的目标

本课题组的总体目标是紧扣国内外SC技术发展趋势，结合临床重大疾病治疗和军事医学发展需求，围绕解决SC临床应用的关键技术问题开展集成研究，建立SC制备、储存及转化应用技术体系，积极而规范地推进SC技术的临床转化应用。重点是针对SC治疗技术的临床转化应用所涉及的关键技术问题，建立SC采集、制备、鉴定、储存、运输和质量控制技术体系及规范，通过人类疾病动物模型治疗实验，解决临床疗效、安全性、机制等问题，研究建立可供临床参照的技术方案。具体方案是针对临床治疗和军事医学需要，提出拟解决的关键技术问题，通过申请科技基金的方式把问题变成项目，通过项目实施形成技术成果，最后把成果转化应用于临床。长期目标是系统性、集成化研究SC应用技术，持续创制新型SC产品并建立SC资源库，按照SC技术临床准入要求开展临床前研究，积极规范地推进SC治疗新技术转化应用。iPSC是未来SC治疗的发展方向，但涉及临床应用的关键技术问题尚存在伦理、安全、免疫、体内演变不可控等问题。我们把iPSC的创制和应用研究作为远期项目，重点开展基础研究，努力突破iPSC诱导技术，积极探讨iPSC的体内生物学效应及机制，为疗效评价及临床研究奠定基础。

2 干细胞治疗研究策略

本课题组利用自身的技术优势，对SC治疗重大疾病的临床前研究技术进行了试探性研究，然后选定重点方向并组织力量进行集中攻关，先后申请并参与承担了国家“973”项目，主持承担国家科技支撑计划、国家自然科学基金、军队医学科技项目、省级科技计划专项等20余个重要课题。我们的研究策略是瞄准临床应用进行系统性研究和协同攻关，从基础工作做起，循序渐进，重点突破，建立集成技术及规范。实施路线：（1）解决SC来源和质量标准问题，制备储存足够数量的临床级SC制剂，为深入研究提供标准化种子细胞；（2）进行SC的安全性评价以保证治疗安全，包括急性过敏、溶血和慢性毒性等；（3）利用疾病动物模型进行治疗实验，评价SC治疗的疗效及机制，并建立相应技术及规范；（4）依据动物实验结果，总结分析并制定临床治疗技术方案；（5）根据三类医疗技术管理要求，申请并开展SC治疗技术的临床研究；（6）在总结分析临床研究结果并保证疗效和安全的基础上，申请临床转化应用。本课题组按照上述技术路线选取了具有临床应用优势的骨髓干细胞（bonemesenchymal stem cell，BMSC）、脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cell，UC-MSC）为重点方向，对SC临床治疗涉及的细胞来源及标准化、临床疗效与安全、临床技术方案等关键技术展开研究。结果建立了BMSC、UC-MSC的规模化制备技术，研制成功SC临床制剂，建成了SC种子资源库；研究开展了人类疾病的动物模型创建工作，利用动物模型评价SC治疗的有效性和安全性，通过动物疾病模型治疗实验建立临床技术方案，同时把疗效机制研究贯穿于动物治疗实验的全过程。

3 骨髓间充质干细胞治疗技术研究

BMSC来源于自体，在临床上具有优先应用的可能性。问题是自体BMSC随年龄增长或因药物、疾病等原因导致数量减少，增殖能力下降，体外扩增相对困难。解决BMSC的来源问题，获得足够数量并符合临床需要的BMSC，是保证临床治疗的有效性和安全性的基础。我们对BMSC的生长特性进行了深入分析，通过优选基础培养基、添加生长因子、改进技术方法等，建立了一套自体BMSC体外制备、扩增与鉴定技术体系[3]。经过重复实验和优化体外培养条件等方法，进一步完善了BMSC体外制备方法，显著提高了BMSC的体外扩增效率，建成了临床级BMSC实验室制备技术及质量控制标准。经生长特性、表型标志、分化潜能、染色体结构及体内生物效应分析，证明利用上述技术体系获得的传代BMSC具有原代BMSC的生物学特性[4]。该项目先后按照技术规范完成了1000余份人和动物BMSC制备与鉴定研究，实现了制备技术规范化、细胞质量标准化，具备了规模化制备和为临床治疗提供自体BMSC的技术条件。

4 脐带间充干细胞技术研究及种子资源库建设

人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell，HUC-MSC）来源于新生儿脐带，具有与BMSC相似的生物学特性，体外生长能力更强大。该细胞的最大特点是取材比较方便，来源丰富，可以实现工厂化生产和储存。理论上，1条长50 cm的脐带经过体外分离并扩增8代左右，可获得1×1010个以上的HUC-MSC，可满足上千人治疗使用，且易于控制质量。该细胞的应用优势是免疫原性低，异体移植一般不会引起明显的毒性和免疫排斥反应，临床应用比较方便。本课题组在多项专项基金支持下，研究建立了相对完善的HUC-MSC材料采集、规模化制备、鉴定技术和质量控制技术和标准，解决了大规模储存、运输和复苏关键技术问题，研制成功了HUC-MSC临床标准化制剂。对HUC-MSC临床制剂进行了急性过敏、溶血等毒性实验，从血液细胞与生化、重要器官功能和组织学结构等方面，系统研究了同种和异种HUC-MSC移植后的慢性毒性反应，证实从1×106～1×107细胞/kg的剂量范围输入同种，甚至是异种HUC-MSC，均不引起明显的急慢性毒性反应。该项目还利用多种肿瘤小鼠模型和健康小鼠，观察了HUC-MSC治疗的促瘤和致瘤性，证明该细胞不会诱发和促进肿瘤生长。在成功研制标准化HUC-MSC制剂的基础上，启动了HUC-MSC库建设，按前期建立的技术规范，制备储存了6000人份（1×107细胞/份）HUC-MSC原代细胞。该研究完成了HUC-MSC中试规模制备技术，建立了HUC-MSC示范库，可为临床治疗和进一步研究提供标准化种子细胞。

5 干细胞治疗的疗效、机制及技术方案研究

SC治疗非血液系统疾病，特别是战创伤修复治疗，首先要解决一些基本问题，其中最重要的是保障安全，弄清其疗效和机制。最基本的是要通过疾病模型治疗研究建立临床技术规范，包括疾病治疗适应证、治疗途径、细胞剂量、疗效评估及安全性等。本课题组在建立BMSC和HUC-MSC制备技术及质量标准的基础上，先后创建了全身性放射伤、骨缺损、缺血性脑损伤、肌萎缩、中毒性肝损伤、急慢性肾损伤、胰腺损伤、代谢综合征、系统性红斑狼疮、肺纤维化、衰老退变、创伤性颅脑损伤等疾病的动物模型，利用这些疾病动物模型进行了BMSC、HUC-MSC等不同来源SC治疗的疗效和安全性研究。通过疾病动物模型治疗实验，分析观察了干细胞在体内迁移、分布、定植、分化和参与或促进损伤修复的部分疗效机制[5-9]，建立了可供临床参考的技术方案。结果发现，MSC具有促进多种损伤的修复、改善代谢功能、抑制自身免疫反应等作用，其体内生物效应机制有：（1）归巢到损伤组织参与损伤修复；（2）分泌多种细胞因子促进损伤组织的原位细胞生长；（3）调节免疫平衡和抑制炎症反应，控制继发性损伤；（4）促进损伤组织的血管再生，改善血液循环；（5）促进抗氧化应激因子表达，减少损伤组织细胞凋亡等。通过分析总结动物实验研究结果，课题组建立12项SC临床治疗方案，其中BMSC治疗神经损伤、肝肾损伤、自身免疫性肝病等技术已按三类医疗技术准入要求申请临床研究。

6 体细胞重编程技术及应用基础研究

体细胞重编程是近年SC技术领域的重大技术突破之一，其核心是利用体细胞核移植、转基因或天然活性物质、小分子化合物等诱导成熟细胞转化为多能干细胞，即iPSC。这类SC具备ESC的强大分化潜能，避免了ESC的伦理、免疫排斥等问题，最具发展前景。目前，美国、日本等国已开展iPSC治疗老年性黄斑病变等疾病临床研究并取得突破。本课题组在动物克隆技术的启示下，开展了卵细胞提取物诱导体细胞重编程技术研究，发现动物卵细胞提取物可诱导皮肤成纤维细胞转化为iPSC，经表观遗传学分析证实，这种方法可诱导SC相关基因Oct-4、Nanog、Sox2、c-myc等去甲基化，从而促使皮肤成纤维细胞转化为SC。通过体外定向诱导分化实验证实，该细胞具有向神经、骨、软骨、肌肉等细胞分化的潜能[10]。利用放射伤、骨创伤、化学诱导性肾和胰腺损伤等动物模型研究，发现该细胞具有促进放射伤动物造血免疫功能重建和参与或促进损伤修复的作用[11]。该研究的重要贡献是发明了诱导体细胞重编程为多能干细胞的新技术，这种技术获得的SC不涉及外源基因转移，临床应用无伦理争议，更具有临床应用优势。该技术目前在国内外未见类似研究报道，具有自主知识产权，值得深入研究。

7 干细胞治疗技术存在的问题及展望

最近10年来，在SC技术研究不断取得突破的同时，临床治疗研究也在发展，国际上有数千个临床研究方案正在实施。国内SC技术应用主要在条件较好的大型综合医院开展HSC移植治疗，而SC治疗非血液系统疾病主要集中于临床前研究。目前，国内SC临床治疗技术尚缺乏有效的监管措施，未建立在技术及规范方面的第三方评价技术体系和机构，还存在商业炒作、过于夸大SC治疗的作用，甚至把SC抗衰老和美容作为卖点大肆进行商业宣传等。有研究表明，SC对损伤、退变、自身免疫、血管缺血等引起的疾病有治疗作用，同时对延缓衰老有一定帮助，但需要在规范管理和保证安全的前提下开展。即便是MSC或HUC-MSC，涉及临床治疗也还有诸多技术问题需要解决，例如治疗的适应证、时机、途径、剂量、次数、疗效评价、作用机制等均需要深入研究，通过大数据分析才能建立技术规范和推广应用。选择一些疗效确切、安全可靠、确实可行的疾病进行临床治疗研究和先行先试是有必要的，但须在技术成熟的基础上进行。

我们的前期研究发现，MSC可有效修复系统性损伤，可降低全身放射损伤的死亡率，促进造血及皮肤、胃肠损伤修复，促进自身免疫损伤，改善肾功能。SC治疗技术对现代高新技术武器伤治疗具有特殊意义，特别是在高新技术武器伤造成的批量系统性损伤的伤员救治中可能发挥重要作用。建议建设国防干细胞库，为战伤救治及应急需要储备一定数量的临床级干细胞制剂；针对提高极端环境（高寒缺氧、高热高湿）军事作业能力及SC治疗复合创伤、新型武器伤的技术和机制开展一些专题研究。随着SC技术的发展及高通量基因测序、蛋白组学、代谢组学、生物芯片等技术的应用，SC在军事医学领域的作用将不断凸现。

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10.3969/j.issn.1004-0188.2015.08.010

2015-03-26）

国家973计划项目（2012CB5181060）;国家自然科学基金(31172170);云南省科技计划重点项目(2013CA005）

650032昆明,成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心，干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省干细胞工程实验室

潘兴华,E-mail:xinghuapan@aliyun.com