肿瘤坏死因子α 308和肿瘤坏死因子α 238位点基因多态性与藏族骨关节结核发病关系研究

李得春



·论著·

肿瘤坏死因子α 308和肿瘤坏死因子α 238位点基因多态性与藏族骨关节结核发病关系研究

李得春

目的 探讨肿瘤坏死因子(TNF)α 308、TNF-α 238位点基因多态性与藏族骨关节结核发病的关系。方法 采用单纯随机抽样法选取2012年10月—2013年10月在青海大学附属医院关节骨病科住院治疗，根据病史、临床表现、X线检查、细菌学检查及病理组织学检查等确诊为骨关节结核的青海地区藏族患者65例为试验组，选取同时段本院青海地区藏族体检健康者50例为对照组。采集受试者清晨空腹外周静脉血3 ml，提取其白细胞基因组DNA；采用等位基因特异引物聚合酶链反应(AS-PCR)分析TNF-α 308、TNF-α 238位点基因多态性。结果 两组TNF-α 308位点等位基因、基因型频率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。试验组TNF-α 308 G/A、A/A基因型频率与对照组比较，差异有统计学意义(χ2=5.85，P<0.05)。两组TNF-α 238位点等位基因频率比较，差异无统计学意义(χ2=2.33，P>0.05)；TNF-α 238位点基因型频率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 青海地区藏族骨关节结核患者中TNF-α 308 A存在过度表达，且TNF-α 308位点基因多态性与青海地区藏族骨关节结核的发病可能有关系；TNF-α 238位点基因多态性与青海地区藏族骨关节结核的发病可能无关系。

结核，骨关节；肿瘤坏死因子α ；多态性，单核苷酸；藏族；聚合酶链反应

李得春.肿瘤坏死因子α 308和肿瘤坏死因子α 238位点基因多态性与藏族骨关节结核发病关系研究[J].中国全科医学，2015，18(6)：465-648.[www.chinagp.net]

Li DC.Relationship between tumor necrosis factor-α 308 and 238 polymorphisms and osteoarticular tuberculosis in tibetans[J].Chinese General Practice，2015，18(6)：465-648.

我国是全球22个结核病高负担国家之一，患者人数居世界第二位[1]。骨关节结核是主要的肺外结核之一，当前全国估计有骨关节结核患者30万例，其发病原因与生活贫困有直接关系[2]。青海省地处偏远地区，经济交通不发达，骨关节结核的发病率较高，尤其是藏族人群，但目前原因尚不明确[3]。骨关节结核的发病是由结核杆菌经血行、淋巴管或由淋巴结核病灶直接蔓延到局部形成播散灶[4]。病情严重者，若诊疗不当可造成脊柱及肢体畸形、关节活动受限甚至截瘫，而目前非典型患者的早期诊断和鉴别诊断较困难[5-6]。

肿瘤坏死因子(TNF)α是一种多向性的细胞因子，主要由活化的巨噬细胞产生，参与巨噬细胞抵抗结核杆菌的感染和结核性肉芽肿的形成，还能诱导巨噬细胞凋亡和其他抗结核细胞因子的释放[7]。TNF-α的产生除了与机体本身免疫系统的活化水平等有关外，宿主自身因素即TNF-α启动子区基因多态性也可能通过影响其转录活性而使其表达水平不同[6]。TNF-α 308 G/A位点基因多态性由Pantelidis等[8]首先发现。该位点位于TNF-α基因编码的启动子区，为一功能性位点。TNF-α基因多态性通过影响基因转录水平而改变TNF-α的表达量，进而影响与TNF-α相关的病理生理过程。本研究通过探讨TNF-α 308、238位点基因多态性对青海地区藏族人群骨关节结核的发生、发展和治疗的作用，以筛选和保护特定环境中的易患人群，并为采取切实有效的干预措施提供依据。

1 资料与方法

1.1 纳入与排除标准 纳入标准：(1)连续3代以上生活在青海境内，且均为藏族；(2)各研究对象之间无任何血缘关系。排除合并肝肾功能异常、HIV、自身免疫性疾病、糖尿病等和长期应用激素者。

1.2 临床资料 采用单纯随机抽样法选取2012年10月—2013年10月在青海大学附属医院关节骨病科住院治疗，根据病史、临床表现、X线检查、细菌学检查及病理组织学检查等确诊为骨关节结核的青海地区藏族患者65例为试验组，其中男33例，女32例；平均年龄(39.2±13.6)岁。选取同时段本院青海地区藏族健康体检者50例为对照组，其中男27例，女23例；平均年龄(39.9±7.4)岁。两组性别、年龄具有均衡性；均签署知情同意书。

1.3 仪器与试剂 96孔梯度PCR仪(德国EPPENDOR公司)，台式离心机5810 R(德国Eppendorf公司)，DYY-8C型电泳仪(北京市六一仪器厂)，凝胶成像分析系统(UVP800，美国)；血液基因组提取试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，德国)，2×PCR反应预混液体(2×PCR MasterMix，北京天根生物技术有限公司)，DNA分子量(北京天根生物技术有限公司)，高纯度琼脂糖(西班牙)。

本文要点：

(1)探讨青海地区藏族人群TNF-α 308、238位点基因多态性与骨关节结核发病易患性之间的关系，为该病的预防、早期诊断和个体化治疗提供新的分子靶向。

(2)TNF-α 308基因多态性与青海地区藏族骨关节结核的发病可能有关系，而TNF-α 238基因多态性与青海地区藏族骨关节结核的发病可能无关系。

1.4 研究方法

1.4.1 提取白细胞基因组DNA 采集受试者清晨空腹外周静脉血3 ml，加入乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝管中，淋巴细胞基因组DNA严格按照所购血液基因组提取试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，德国)说明书操作提取，采用梯度离心法(12 000 r/min 室温离心15 min，离心半径为25 cm)提取基因组DNA，并于-20 °C保存。

1.4.2 分析TNF-α 308、TNF-α 238位点基因多态性 从美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站获取人类TNF-α基因全序列，利用Dnaman 6.0软件设计引物，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成；根据PCR试剂盒构成反应体系，并完成扩增。TNF-α 308 G/A 扩增引物序列为上流引物：5′-AATAGGTTTTGAGGGGCAAGG-3′，下游引物：5′-AGGGAGCGTCTGCTGGCT G-3′。TNF-α 238 G/A扩增所用引物参照文献[9]，引物序列为上游引物：5′-CCGTGCTTGGTGCTTTGGACTA-3′，下游引物：5′-AGAGCTGGTGGGGACATGTCTG-3′。在96孔梯度PCR仪中进行等位基因特异引物聚合酶链反应(AS-PCR)，分析TNF-α 308、TNF-α 238位点基因多态性。PCR反应体系总体积为25 μl，包括2×PCR MasterMix 12.5 μl，上下游引物(10 μmol/L)各1 μl，模板DNA 2 μl，无RNA/DNA酶水8.5 μl。反应条件：95 °C预变性2 min，94 °C变性1 min，63.3 °C退火1 min，72 °C延伸1 min，循环30次，最后经72 °C延伸5 min，4 °C终止反应，产物取出后于-20 °C保存。采用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，确定等位基因及基因型：取PCR扩增产物5 μl经1%琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像分析系统判断结果。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。采用Hard-Weinberg遗传平衡分析检验样本是否具有群体代表性。采用直接计数法计算各组等位基因和基因型频率。计数资料组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人白细胞基因组DNA琼脂糖凝胶电泳分离鉴定结果 可见单一的明亮条带，表明所提取的DNA无降解(见图1)。

图1 人白细胞基因组DNA琼脂糖凝胶电泳分离鉴定结果

Figure 1 Results of agarose gel electrophoresis separation of leukocyte genomic DNA

2.2 TNF-α 308、TNF-α 238位点等位基因与基因型的鉴定

2.2.1 TNF-α 308位点等位基因与基因型的鉴定 PCR产物中出现135 bp条带为GG基因型(野生型纯合子)，出现360 bp条带为AA基因型(野生型纯合子)，135 bp、360 bp条带同时出现为GA基因型(突变型杂合子，见图 2)。

注：M=Marker

图2 TNF-α 308位点等位基因与基因型的鉴定

Figure 2 Identification of promoter allele and genotype of TNF-α 308

2.2.2 TNF-α 238位点等位基因与基因型的鉴定 PCR产物中出现206 bp条带为GG基因型(野生型纯合子)，出现287 bp条带为AA基因型(野生型纯合子)，206 bp、287 bp条带同时出现为GA基因型(突变型杂合子，见图3)。

注：M=Marker

图3 TNF-α 238位点等位基因与基因型的鉴定

Figure 3 Identification of promoter allele and genotype of TNF-α 238

2.3 Hard-Weinberg遗传平衡检验 TNF-α 308、TNF-α 238位点等位基因与基因型在两组中分布频率均符合遗传平衡定律，两组样本来自于遗传平衡群体，有较好的代表性(χ2=12.36，P<0.05)。

2.4 TNF-α 308、TNF-α 238位点等位基因及基因型频率比较 两组TNF-α 308位点等位基因、基因型频率比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。试验组TNF-α 308 G/A、A/A基因型频率与对照组比较，差异有统计学意义(χ2=5.85，P<0.05)。两组TNF-α 238位点等位基因频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；TNF-α 238位点基因型频率比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

表1 TNF-α 308位点等位基因及基因型频率比较〔n(%)〕

Table 1 Comparison of promoter allele and genotype frequencies of TNF-α 308

组别例数等位基因G A基因型G/G G/A A/A对照组5099(990)1(10)49(980)1(20)0试验组65118(908)12(92)55(846)8(123)2(31)χ2值718-P值00070033∗

注：-为无此项，*采用Fisher确切概率法

表2 TNF-α 238位点等位基因及基因型频率比较〔n(%)〕

Table 2 Comparison of promoter allele and genotype frequencies of TNF-α 238

组别例数等位基因G A基因型G/G G/A A/A对照组5097(970)3(30)48(960) 1(20) 1(20)试验组65120(923)10(77)55(846)10(154)0χ2值233-P值01270015∗

注：-为无此项，*采用Fisher确切概率法

3 讨论

骨关节结核是由结核杆菌通过血液或淋巴系统播散至骨与关节，造成血供丰富和负重大或活动较多的骨关节发生坏死[10]。研究表明，TNF-α能通过与破骨细胞前体细胞上的相应受体结合，直接或间接调节破骨细胞的分化、激活和凋亡[11-12]。王翔锋等[13]研究发现，当结核患者的外周血单核细胞体外培养加入结核杆菌相关抗原2 d后，细胞培养液中的TNF-α水平明显升高。这表明TNF-α在结核杆菌感染过程中起到了重要的调控作用。TNF-α的产生除了与机体本身免疫系统的活化水平等有关外，宿主自身因素即TNF-α启动子区基因多态性也可能通过影响其转录活性而使其表达水平不同。研究资料显示，TNF-α基因多态性影响其产物的表达，不同的基因型可以产生不同的蛋白，从而影响疾病的易患性及严重性，但TNF-α基因多态性对骨关节结核发病的作用还鲜有报道[7]。

本研究对中国青海地区藏族骨关节结核患者TNF-α 308、TNF-α 238 位点等位基因及基因型进行鉴定，并与正常藏族受试者进行比较。结果显示，试验组和对照组TNF-α 308位点基因型的分布频率存在差异，A/A基因型在试验组分布频率为3.1%，而在对照组未发现该基因型，A/A、G/A基因型与G/G基因型相比，其相对危险度要高很多[14]。由于基因型为TNF-α 308 A/A的藏族人群少[15]，无法直接比较TNF-α 308 A/A藏族人群与TNF-α 308 G/A藏族人群患骨关节结核的危险性。本研究将各组TNF-α 308 A/A型与TNF-α 308 G/A型合并进行比较，结果显示，试验组TNF-α 308 G/A、A/A基因型频率明显高于对照组；试验组TNF-α 308 A等位基因频率也明显高于对照组。说明青海地区藏族骨关节结核患者中TNF-α 308 A存在过度表达，揭示TNF-α 308 A等位基因可能是青海地区藏族骨关节结核的一种遗传易患因子，TNF-α 308位点基因多态性与青海地区藏族骨关节结核的发病可能有一定的相关性；此外本研究显示，试验组和对照组青海地区藏族骨关节结核TNF-α 238位点等位基因频率无差异，提示TNF-α 238位点基因多态性与青海地区藏族骨关节结核的发病可能不存在相关性，这与林春燕等[16]的研究结果一致。

本研究并未将TNF-α 308、TNF-α 238位点基因多态性与其他民族骨关节结核发病进行比较，且本研究样本量较小，这也是以后研究的方向和需要注意的问题，研究结果仍需多中心大样本试验的进一步验证。

综上所述，青海地区藏族骨关节结核患者中TNF-α 308 A存在过度表达，且TNF-α 308基因多态性与青海地区藏族骨关节结核的发病可能相关；TNF-α 238基因多态性与青海地区藏族骨关节结核的发病可能没有关系。

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(本文编辑：崔丽红)

Relationship between Tumor Necrosis Factor-α 308 and 238 Polymorphisms and Osteoarticular Tuberculosis in Tibetans

LIDe-chun.

DepartmentofJoint,QinghaiUniversityAffiliatedHospital,Xining810001,China

Objective To investigate the relationship between the polymorphisms of tumor necrosis factor (TNF) α 308 and TNF-α 238 and osteoarticular tuberculosis (OATB) in Tibetans.Methods A total of 65 patients confirmed as OATB by medical history,clinical manifestations,X-ray examination,bacteriological test and histopathological findings in Qinghai University Affiliated Hospital from October 2012 to October 2013 were selected as experiment group by simple random sampling method,while 50 healthy Tibetans from Qinghai area who had physical examination during the same period were selected as control group.3 ml peripheral venous blood of the subjects was collected on an empty stomach in the morning,and then leukocyte genomic DNA was extracted.Allele-specific polymerase chain reaction (AS-PCR) was used to analyze the promoter allele polymorphism of TNF-α 308 and TNF-α 238.Results The promoter allele and genotype frequency of TNF-α 308 between the two groups showed statistically significant differences (P<0.05).Compared with the control group,TNF-α 308 G/A and A/A genotype frequency of the experiment group showed statistically significant difference (χ2=5.85,P<0.05).The TNF-α 238 promoter allele frequency between the two groups showed no statistically significant differences (χ2=2.33,P>0.05),but the TNF-α 238 genotype frequency showed statistically significant differences (P<0.05).Conclusion Tibetans with OATB in Qinghai area have overexpression of TNF-α 308 A.The TNF-α 308 polymorphism may be related to the development of OATB among the Tibetans in Qinghai area,but TNF-α 238 polymorphism may be not related to it.

Tuberculosis,osteoarticular;Tumor necrosis factor-alpha;Polymorphism,single nucleotide;Zang nationality;Polymerase chain reaction

810001 青海省西宁市，青海大学附属医院关节骨病科

R 529.22

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.06.009

2014-05-04；

2014-11-28)