副猪嗜血杆菌病细菌分离及PCR检测方法的建立与应用

郭蕊

(河北省昌黎县动物疫病预防控制中心，河北昌黎066600)

副猪嗜血杆菌病细菌分离及PCR检测方法的建立与应用

郭蕊

(河北省昌黎县动物疫病预防控制中心，河北昌黎066600)

本病又称为革拉斯病（Glsser Disease），是由副猪嗜血杆菌引起的猪的又一种新的细菌性传染病，以多发性浆膜炎和关节炎为特征，主要表现为发热、咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行、共济失调和被毛粗乱、胸膜炎、肺炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。也可引起母猪流产、公猪慢性跛行。该病目前呈世界性分布，在我国的发病也呈上升的趋势，造成的经济损失日益严重，但猪副嗜血杆菌病与猪链球菌病、猪传染性胸膜肺炎（嗜血杆菌）等可引起呼吸系统的疾病不易区分，且混感率较高，为该病的诊断带来一定的困难。

副猪嗜血杆菌为革兰氏染色阴性，有荚膜，具有多种不同的形态。该菌生长时严格需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD或V因子）。流行菌株在TSA平板的菌落呈针尖大小、灰白色、透明。本菌至少有15种血清型，另有大量分离株血清型不可定型，目前在我国的主要流行菌株是4、5、14和15型等，且不同地区不同分离菌株致病力差异较大。14～120日龄的猪均易感，但通常见于5～8周龄的猪发病。发病率 10%～15%，严重时死亡率可达50%～60%。

因此为了保证诊断的准确性，在最短的时间内对猪群进行处理，继而降低经济损失，我们采取细菌分离与PCR结合的方法来对其进行研究。

1 材料

1.1 实验动物

某发病猪场的病猪及送检病、死猪。

1.2 临床症状

发热、食欲不振、厌食、反应迟钝、呼吸困难、咳嗽、疼痛（尖叫）、关节肿胀、跛行、颤抖、共济失调、可视黏膜发绀、侧卧，消瘦和被毛凌乱，随之可能死亡。急性感染后可能留下后遗症，即母猪流产、公猪慢性跛行。肉眼病变主要是全身性浆液性、化脓性、纤维素性炎症，包括心、肺、肝等内脏器官、腹膜、心包膜、胸膜、及其关节表面（图3～6）等，尤其是腕关节和跗关节，出现浆液性和化脓性纤维蛋白渗出物。诊断本病时应注意与链球菌、胸膜肺炎放线杆菌、支原体多发性浆膜炎和关节炎等相区别，本病确诊有赖于细菌学以及分子生物学检查。

2 细菌学检测

2.1 主要试剂与仪器

牛血清、TSA、辅酶I(烟酞胺腺嘌呤二核苷酸NAD)、培养基、培养箱、电子秤、摇床、高速冷冻离心机等。

TSA固体培养基:准确称取胰蛋白大豆琼脂(TSA)40克，加入940毫升蒸馏水，充分摇匀后加热至充分溶解，高压蒸汽灭菌15分钟，加入50毫升过滤除菌的牛血清、10毫升过滤除菌的0.01%NAD，充分摇匀后倒平皿。

2.2 实验方法

无菌采集胸膜、胸腹腔积水、心包积液、关节液等病料，分别接种于自制的TSA固体培养基平板，置于5%～10%CO2中培养，37℃恒温箱培养24～48小时后，检查其在培养基上的生长表现、菌落特征等培养特性，结果显示菌株在TSA平板的菌落呈针尖大小、灰白色、透明（图1），然后纯培养与鉴定。

对培育菌株进行革兰氏染色以及培养后接种于脉酶、氧化酶、接触酶、硝酸盐还原、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麦芽糖等微型生化鉴定管等进行生化指标的测定，37℃培养，24～48小时后观察现象。革兰氏染色阴性，多种不同形态的小杆菌（图2）。

将培育菌株划线接种于鲜血琼脂平皿，用纸片法将20种药物进行药敏试验，37℃胚培养24～36小时，观察结果显示：本菌对红霉素、氨基甙类、壮观霉素和林可霉素有抗药性。

3 PCR检测

3.1 主要试剂与仪器

电泳缓冲液TAE、PBS、DNA marker、EB、各种型号移液器及滴头、氯仿以及其他分析纯等。

PCR仪、电泳仪、电子天平、超净工作台、水浴锅、高速低温离心机、高压灭菌锅等。

3.2 实验步骤

将被检菌液12000转/分钟离心5分钟，弃上清液，用无菌水悬浮，涡旋后于沸水中水浴10分钟后，再放置-20℃冻结，然后12000转/分钟离心5分钟，取上清液作为DNA模板。根据副猪嗜血杆菌序列设计引物，由上海生某公司合成。

采用50微升反应体系：上下游引物1.5微升，2.5毫摩尔 dNTPs 4.0微升，Exbuffer 5.0微升，ExTaq酶0.5微升，模板DNA 8.0微升、灭菌双蒸水30微升。反应循环参数：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸40秒，共30循环；最后72℃延伸10分钟，4℃保存。反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增片段的大小。

1%琼脂糖凝胶的配制:称取3克琼脂糖，加入300毫升lxTAE溶液，微波炉加热至完全溶解。稍微冷却，加入溴化乙锭(EB至终浓度为5微克/毫升)，趁热倒入制胶槽，高度约0.5厘米，自然凝固后，小心拔出梳子，将平板放入电泳槽中，加样孔一端朝向阴极。电泳槽内倒入足够的lxTAE溶液，使之正好没过制好的琼脂面。

加样:PCR产物15微升与3微升6x加样缓冲液混合均匀，用微量进样器吸取混合液，Tip头伸入液面以下，对准加样孔，缓慢推出使样品垂直落入加样孔内。电泳:盖上电泳槽电泳40～50分钟，然后在凝胶成像仪中观察结果。

3.3 实验结果

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，获得约822碱基对的特异性片段，与预期结果相符。经序列测定，其序列与目的基因序列一致。

M：DNA Marker；1：目的基因的扩增产物

4 结论

4.1 近年来，该菌在我国猪群普遍存在（感染率呈明显的上升趋势），且临床症状又与链球菌、胸膜肺炎放线杆菌等疾病极其相似不易区分，因此必须要通过细菌分离及PCR检测的方法进行确诊，避免因误诊造成不必要的损失。

4.2 副猪嗜血杆菌抗药性日渐增强也已成为不可忽视的问题，疾病发生的早期，治疗或保健性预防用药效果明显，但一定要选择敏感的抗菌素药物。大多数副猪嗜血杆菌对头孢类抗生素、氟苯尼考、替米考星及喹诺酮类高度敏感，但对一些氨基甙类、壮观霉素和林可霉素有抵抗力，所以说，对猪场副猪嗜血杆菌进行定期的敏感性药物监测，有利于减少经济损失，保证猪群健康。

4.3 副猪嗜血杆菌疫苗是预防该病的最为有效的方法之一，但不同血清型菌株之间的交叉保护率相对较低，因此，疫苗的使用具有一定的区域性和局限性，一定要有血清型的针对性才能取得良好的防疫效果。从当地分离的菌株制备灭活苗，可有效控制副猪嗜血杆菌病的发生。同时做好猪瘟、伪狂犬病、蓝耳病、口蹄疫等预防免疫工作，有利于减少本病的发生。

4.4 同时加强对猪群饲养管理。保证勤打扫，常通风，实行严格的定期消毒制度，特别是冬季一定要做好保温与通风的协调，尽量减少应激。减少或消除其他呼吸道病原，如提前断奶，减少猪群流动，杜绝猪生产各阶段的混养状况等，并在疫病多发季节，在饲料中添加增强体质的药物如：黄芪多糖、电解多维、VC、VE以增强机体抵抗力，减少应激，都可有效增强猪体自身免疫力减少本病的发生。

图1 副猪嗜血杆菌菌落形态

图2 副猪嗜血杆菌形态

图3 心包积液，心脏周围出现纤维素性炎症

图4 肺脏包膜

图5 肺脏黏连

图6 腹腔出现化浓性炎症