肺抑瘤膏对血瘀体质lewis荷瘤小鼠血流变学的干预作用

第一作者：郑心(1964—),女，主任医师。

★　郑心*　孟宪志

(山东中医药大学第二附属医院　济南 250001)

肺抑瘤膏对血瘀体质lewis荷瘤小鼠血流变学的干预作用

*第一作者：郑心(1964—),女，主任医师。

★郑心*孟宪志

(山东中医药大学第二附属医院济南 250001)

摘要：目的：观察肺抑瘤膏对血瘀体质lewis荷瘤小鼠血流变学的干预作用。方法：首先进行血瘀体质模型的建立，继而进行lewis肿瘤细胞的接种，将体质造模成功并且荷瘤成功的小鼠随机分为血瘀对照组和血瘀给药组，给药组给予肺抑瘤膏灌胃，观察两组小鼠外周血Fib、D-dimer、全血黏度的差异性。结果：肺抑瘤膏可以有效改善血瘀体质荷瘤小鼠的高凝、高黏状态。结论：对肿瘤患者偏颇体质进行调整，是中药治疗肿瘤的一种思路和方法。

关键词：肺抑瘤膏；lewis；血瘀体质；血流变学

1实验材料

1.1实验动物及细胞株动物品系C57BL/6近交系小黑鼠，等级SPF级别，雄性，6～8周龄，体重(18±2)g，65只。质量检测单位：中国医学科学院医学实验动物研究所；出售单位：北京华阜康生物科技股份有限公司(许可证号：SCXK(京)2009-0004)；饲养环境：温度范围20℃～22℃，相对湿度范围(50±5)%，通风良好，小鼠维持饲料喂养，自由采食，饮水，根据垫料清洁干燥程度及时进行更换垫料。

Lewis肺癌细胞株，由山东省医学科学院提供并予以接种，接种所用小鼠为全部小鼠随机抽取5只。接种成功后送往实验室进行常规饲养，再随机抽取10只作为传代用小鼠。

1.2主要实验试剂盐酸肾上腺素注射液，规格1mL：1mg，购自上海禾丰制药有限公司。

1.3主要实验器材德国Sartorius实验室专业天平自动血流变测试仪、生物显微镜、光学显微镜，超净工作台、高速台式低温离心机、制冰机等均由山东省疾病控制中心提供。

1.4主要实验药物肺抑瘤膏处方：党参24g，黄芪18g，炒白术12g，茯苓15g，麦冬20g，白花蛇舌草24g，半枝莲24g，薏苡仁30g，浙贝母15g，贯众15g，夏枯草18g，女贞子21g，山慈菇21g，莪术18g，蜂房15g，甘草6g，阿胶12g。

药物由山东中医药大学第二附属医院中药房提供，10倍剂量加蜂蜜60g加工制成。

2实验分组、方法及评价标准

为保证实验连贯性，本次实验分为两个部分同时进行，即血瘀体质造模与肿瘤细胞传代培养。

2.1血瘀体质造模阶段分组、方法及评价标准

2.1.1分组方法在剩余的50只小鼠中随机抽取10只作为体质造模对照组，剩余40只作为体质造模组。

2.1.2造模方法参考周氏[1]血瘀证小鼠动物模型建造方法，设计血瘀体质造模方法。具体如下：每天9:00进行小鼠颈背部皮下注射盐酸肾上腺素，按照小鼠体重0.08mg/100g的剂量，并用生理盐水调整液体体积为0.2mL，每天注射1次，连续注射1周。对照组注射相同剂量的生理盐水，注射操作均由一人完成。

2.1.3评价标准由于小鼠取血后即死亡，为了保证下一步中药干预实验的进行，故只选用小鼠宏观表征来进行观察，包括小鼠生活习性、饮食量、毛发情况、脉络瘀血情况(口周、齿龈爪甲、耳缘、肛周紫黯)。

2.2肺抑瘤膏干预阶段分组、方法及评价标准

2.2.1Lewis肺癌模型建立方法将已经购买的荷瘤小鼠于SPF级动物房常规饲养，等待14天，肿瘤得到充分生长，行颈椎脱臼法将小鼠全部处死，于超净工作台上进行肿瘤的剥离操作，操作时培养皿下当放置冰袋以控制温度，使用镊子和剪刀完整剥离瘤体，同样放置在垫以冰袋的培养皿上面，用无菌生理盐水进行冲洗，将肿瘤组织周围的坏死组织、脂肪、血管等与瘤体分离，良好的肿瘤组织当为肉眼观察的鱼肉样组织。将取出的肿瘤组织迅速放入200目过滤网中，加入少量无菌生理盐水，用研磨棒充分研磨，取混悬液放入高速低温离心机离心3次，取上清液。根据李氏[2]的实验研究结果及本课题预实验结果显示，将细胞悬液浓度调整至1×107/mL。并在电子光学显微镜下进行细胞计数，保证活细胞数量在95%以上方可。迅速将调整好浓度的细胞混悬液接种至荷瘤组的10只小鼠右侧腋下，每只注射0.2mL,整个操作过程要求在1h之内完成。接种成功判断标准：接种1周后可于小鼠右侧腋下出现可触摸到瘤结节，即为造模成功。

将10只接种成功的小鼠进行常规饲养，待14d后肿瘤充分生长之后，重复上述步骤操作，将调整好浓度的肿瘤细胞悬液，按照之前操作要求迅速接种于体质造模完成的40只小鼠右侧腋下，每只接种0.2mL,造模过程要求在1h之内完成。在接种肿瘤1周后，将接种失败的小鼠脱落处理，本次接种无脱落小鼠。

2.2.2分组及给药方法将血瘀体质造模成功并且荷瘤成功的40只小鼠随机平均分为两组。一组为血瘀对照组，一组为血瘀给药组。血瘀给药组每天两次给予肺抑瘤膏灌胃，每次每只0.2mL肺抑瘤膏(相当于生药量40g/kg)，血瘀对照组每天两次给予0.2mL生理盐水灌服。

2.2.3观察指标小鼠纤维蛋白原(Fib)、D-2聚体(D-dimer)、全血黏度。两组小鼠行眼眶取血，每组10只血样送往山东中医药大学第二附属医院化验科进行Fib、D-dimer检测；剩余10只血样用血流变自动检测仪分别以10S-1、50S-1、200S-1三个切变率进行全血黏度检测。

3统计分析

本课题数据均使用SPSS17.0软件进行统计分析。

4实验结果

4.1造模阶段小鼠宏观表征观察结果体质造模1周后，相较于对照组小鼠，血瘀体质造模组小鼠出现喜扎堆、活动量减少、偶有几只出现蜷缩少动。通过每天食量观察，发现小鼠进食量逐渐减少，形体相对对照组略显消瘦，毛发出现不规整，毛色黯无光泽；通过观察小鼠口周、齿印爪甲、耳缘以及肛周，发现出现不同程度的脉络瘀血，少则1处，多则3处，认为全部造模成功。

4.2中药干预阶段小鼠Fib、D-dimer、全血黏度观察结果见表1

表1　小鼠Fib、D-dimer、全血黏度结果

注：上述两组数据进行差异性检测，五个指标均P<0.05。

5讨论

血瘀体质是诸多体质中一种重要的体质。血瘀体质的存在常导致机体出现血运不畅，甚或瘀血内阻的病理基础，进一步导致整个机体脏腑组织的血运障碍。早在《黄帝内经》中就有“素有恶血在内”的表述。现代研究发现，血瘀体质个体常存在明显的血液流变学改变，表现出“浓、粘、凝、聚”的特点，同时也存在着血液高凝状态及纤溶亢进状态。流行病学发现，血瘀体质的群体更容易导致肿瘤的发生；而肿瘤一旦产生，其存在又可以通过多种机制造成患者血液的高凝、高黏状态。既往研究也发现恶性肿瘤的发生发展与高凝状态密切相关[3]。同时高凝、高黏状态也是肿瘤生长和转移的危险因素[4]。

目前，中医药治疗肿瘤取得了很大的进步，但是在理论研究方面还有待补充和完善。通过体质的角度进行中药抗肿瘤的研究尚未大范围展开。本次实验即选择了血瘀体质作为治疗肺癌的切入点，选用了在临床中疗效显著的肺抑瘤膏进行动物实验。实验通过模拟患者的血瘀体质进行血瘀体质小鼠模型的构建，再在其基础上进行lewis细胞的接种，构建血瘀体质肺癌的双重模型，最后应用肺抑瘤膏进行干预。本次实验结果发现，肺抑瘤膏可以很好的改善小鼠模型的血流变指标，改善了在体质与肿瘤双重作用下的外周血高凝、高黏状态。由此可以得出一个结论：对肿瘤患者的偏颇体质进行调整，是中药治疗肿瘤的一种思路和方法。

参考文献

[1]周华妙,郭勇.寒凝血瘀证小鼠动物模型的建立及评价[J].中国中医药科技,2010,17(1):1-2,7.

[2]李春艳,王颖,刘浩,等.C_(57)BL/6近交系小鼠Lewis肺癌动物模型:建设性描述肺癌损害程度的指标[J].中国临床康复,2003,7(26):3 582-3 583.

[3]耿振英,张侠.高凝状态与恶性肿瘤[J].中国微循环,2008,12(5):323-325.

[4]Elalamy I, Verdy E, Gerotziafas G, et al. Pathogenesis of venous throm- boembolic disease in cancer[J].Pathologie-biologie,2008,56(4):184-194.

收稿日期：(2014-12-16)编辑：万崇毅

中图分类号：R285.5

文献标识码：A