创伤/烧伤后单核-巨噬细胞变化及调节措施研究进展

马晓媛，靳 贺，梁华平

严重创伤/烧伤可致机体各器官和组织发生一系列病理生理改变，其病理机制涉及神经－内分泌－免疫网络以及凝血、纤溶、血管内皮细胞系统等。单核－巨噬细胞是介导体内炎症反应的主要效应细胞之一，在损伤相关模式识别分子及病原体相关模式识别分子的刺激下可迅速产生多种炎症介质，启动全身炎症反应综合征(SIRS)、代偿性抗炎反应综合征(CARS)或混合拮抗反应综合征(MARS)的级联反应病理过程，最终导致机体的免疫功能紊乱及多器官功能的损害。深入研究严重创伤/烧伤后单核-巨噬细胞的变化规律，阐明其变化的分子机制，提出相应的免疫调节措施则可为临床创伤/烧伤患者的救治提供新的策略。本文就近年来单核－巨噬细胞在创伤/烧伤领域中的相关研究进展作一简要概述。

1 严重创伤/烧伤后单核－巨噬细胞数量及功能的改变

众所周知，机体遭受创伤/烧伤后，先后有中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞侵润到伤口(道)或创面部位，清除创伤局部的坏死组织、细胞碎片及污染的病原微生物，并参与创面愈合和组织修复过程。近年来大量研究证实，创伤/烧伤后可致机体全身的单核－巨噬细胞的数量和功能发生改变，进而介导伤后的免疫功能紊乱及多器官的炎性损害进程。

1.1 严重创伤/烧伤后单核-巨噬细胞亚群及数量变化Noel等［1］报道了热力损伤能增加骨髓、脾脏及外周血中炎性单核细胞的数量。Howell等［2］在研究中发现烧伤后粒细胞单核细胞前体细胞(GMPs)中升高的巨噬细胞活化因子家族转录活化因子B(MafB)可通过下调红系特异核蛋白转录因子(GATA-1)及上调巨噬细胞集落刺激因子受体(M-CSFRs)的表达量，进而抑制单核细胞分化为树突状细胞，但可促进其分化为巨噬细胞。也有学者发现，严重创伤患者单核细胞白细胞分化抗原(CD14highCD16+)亚群明显扩增，该亚群单核细胞可产生抗炎细胞因子，与创伤后的免疫抑制状态相关［3］。

1.2 严重创伤/烧伤后单核-巨噬细胞功能变化 严重创伤/烧伤不仅可致单核－巨噬细胞的吞噬、杀菌功能降低，抗原递呈功能减弱，还可改变其活化状态、表面抗原的表达、分泌功能及相关蛋白酶水平。Lopez等［4］发现，从烧伤小鼠体内分离出的腹腔巨噬细胞对脂多糖(LPS)的刺激呈现高应答状态，提示烧伤可诱导巨噬细胞的活化。Oh等［5］在氢氧化钠(NaOH)制备烧伤小鼠眼模型中发现巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)在眼表面表达量高于正常水平，而MIF可刺激巨噬细胞的活化，通过促进环氧酶(Cox-2)，抑制p53通路以阻止巨噬细胞因失活而导致的凋亡，从而维持机体的炎性反应。然而在创伤后期特别是创伤后脓毒症阶段单核细胞则发生失活，且该变化与创伤后脓毒症患者的高死亡率相关［6］。

无论是创伤还是烧伤均可致单-巨噬细胞表面人白细胞抗原(HLA-DR)的表达量降低［2］，其下降程度和持续时间与损伤严重程度密切相关。Yang等［6］进一步发现，烧伤患者外周血中CD14+单核细胞表面HLA-DR的表达明显低于正常人，且与其第1、7、28天后分泌的IL-10呈负相关。有学者发现烧伤后24h单核细胞表面CD47表达持续下降，并且CD47的低表达与烧伤后早期严重程度有关［7］。由于CD47在单核细胞及其分化出的树突细胞中均扮演了死亡受体的角色，故认为烧伤患者CD47的低表达可增加单核细胞的数量及单核细胞表面CD14表达量。Toll样受体是参与机体免疫应答的一类重要跨膜分子，研究发现肺泡巨噬细胞表面Toll样受体(TLR4)在小鼠胸部钝性伤48h后表达量显著增高，TLR4的启动可以防御机体在创伤后感染某些革兰阴性菌［8］。

严重热力损伤也可导致巨噬细胞的分泌功能发生改变，如前列腺素E2(PGE2)生成增加、白细胞介素-12(IL-12)生成减少，进而引起辅助性T细胞(Th2)介导的的抗炎因子IL-4与IL-10的产生增多［9］。已有研究证实严重烧伤早期肝脏Kupffer细胞(KCs)是机体释放细胞因子的主要来源之一，如分泌促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1［10］。Neunaber等［11］在大鼠创伤模型中发现，股骨骨折经髓内固定后伴或不伴随胸部钝性伤均可促进肺泡巨噬细胞(AM)和肝脏Kupffer细胞分泌IL-6、TNF-α、趋化因子2(CCL2)、CCL3、CCL4、CCL5和CCL7在内的细胞因子，进而激活机体免疫应答。Qin等［12］在探究醉酒后发生烧伤的患者机体炎症反应及免疫功能的变化时发现，巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达水平下调，该变化参与介导了烧伤后的免疫功能失衡。West和Mold［13］发现创伤患者单核细胞内血红素加氧酶1(HO-1)水平增加，但并未发现其与HLA-DR表达降低及单核细胞的失活相关。

2 创伤/烧伤后单核-巨噬细胞功能变化的分子机制

2.1 PI3K/Akt信号通路活性受抑，致单核-巨噬细胞黏附力和吞噬能力下降 磷酯酰肌醇3激酶/丝氨酸激酶(PI3K/Akt)信号通路在细胞代谢、细胞周期调控、细胞凋亡等多种生物学过程中发挥重要作用。近期有研究者在电灼伤模型中发现经电灼伤的小鼠血清可诱导单核细胞分泌TNF－α并增强单核细胞与血管内皮细胞的黏附能力，通过阻断PI3K/Akt信号通路可以抑制单核细胞与血管内皮细胞的黏附［14］。Hsieh等［15］在创伤失血小鼠模型中发现肝脏Kupffer细胞噬菌能力降低，但该变化与细胞缺氧及HIF-1的活性升高无关，而与Akt的活性受抑制有关［16］。

2.2 MafB(V-maf musculoaponeurotic fibrosacroma oncogene homolog)信号通路活化，上调巨噬细胞的分化 严重烧伤小鼠骨髓中多能造血干细胞及粒细胞单核细胞前体细胞(GMPs)的数量显著增加。烧伤小鼠GMPs的球蛋白转录调节因子(GATA-1)表达明显降低，而该因子对树突状细胞(DC)的分化是必需的。与此相反，烧伤小鼠GMPs的MafB与M-CSFRs的表达呈现高水平，这二者均与单核细胞的生成有关。与假伤组相比，来自烧伤组小鼠的GMPs向巨噬细胞分化的数量升高至1.7倍以上，而向DC分化的数量降低至1.6倍以下。进一步分析发现，烧伤后GMPs中升高的MafB可通过下调GATA-1及上调M-CSFRs的表达量，进而抑制单核细胞分化为DC，但促进其分化为巨噬细胞［2］。

2.3 Fas/FasL信号通路激活，调节促炎和抑炎介质的产生Seitz等［17］在大鼠胸部创伤模型中发现肺泡巨噬细胞表面Fas/FasL系统被激活，由于FasL的激活，导致肺泡巨噬细胞释放促炎因子。Niesler等［18］学者也发现肺泡巨噬细胞(AM)表面FasL与Fas受体结合后，激活Fas/FasL系统，这不会诱发AM发生凋亡，但会改变细胞因子的释放。在实验中证实遭受胸部钝性伤后的大鼠体内使用可溶性FasL刺激后，AM中IL-6水平升高，IL-10水平下降，然而单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)表达无明显改变。这些结果均提示Fas/FasL系统在胸部创伤后介导机体炎症应答过程中的确表现出重要作用。

2.4 NF-κB信号通路活化，影响细胞因子的分泌 NF-κB在创伤后炎症反应中，通过提高p65/p50磷酸化水平或提高与相应DNA位点结合，从而激活该信号通路以介导炎症介质的生成。Lopez等［4］通过分析烧伤小鼠腹腔巨噬细胞在LPS刺激下的NF-B的p65Ser536磷酸化水平，发现其水平增高与其对LPS的高应答状态及过度激活密切相关。Suzuki等［19］在创伤出血模型中发现过氧化物酶增殖物激活受体(PPAR)通过提高NF-B与相应DNA位点结合促进了肝脏Kupffer细胞释放细胞因子。有学者发现创伤失血模型小鼠Kupffer细胞吞噬功能降低的同时，伴有p38 MAPK和NFB活性增加［16］。Chen等［10］将烧伤大鼠肝脏Kupffer细胞进行体外培养，发现经过高迁移率族蛋白1(HMGB1)刺激后，通过TLR信号转导通路介导肝脏Kupffer细胞的NF-B活性增加，进而增强促炎因子TNF-α、IL-1的分泌。

2.5 MCP-1/CCL-2及CCR2信号通路激活，增强单核-巨噬细胞的趋化能力但下调炎症反应 Seitz等［20］观察到胸部损伤后肺泡灌洗液中趋化因子水平、肺巨噬细胞数量和单核细胞迁移至肺部的百分比均升高。同时发现肺挫伤提高了单核细胞、肺间质巨噬细胞CCR2的mRNA表达及肺巨噬细胞中单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的mRNA表达。由此可见，胸部钝性伤后肺巨噬细胞可通过释放趋化因子，从而提高潜在的刺激单核细胞迁移的能力，而单核细胞通过上调这些趋化因子受体的表达，然后迁移至肺组织。Suresh等［21］在肺挫伤小鼠体内发现，肺组织中MCP-1/CC趋化因子配体-2(CCL-2)水平明显增高，进一步实验证实，应用多克隆抗体中和CCL-2后，损伤肺组织灌洗液中白蛋白、IL-6含量增加且肺组织中髓过氧化物酶活性更高;应用CCR2－/－小鼠制备肺损伤模型，其释放的IL-1、IL6、巨噬细胞炎性蛋白-1(MIP-1)、角质细胞趋化因子(相当于人IL-8)及浸润的中性粒细胞更多，肺泡巨噬细胞虽然减少但以M1表型(促炎表型)为主，说明肺挫伤后升高的CCL-2可通过作用于CCR2下调炎症反应从而发挥对肺损伤的保护作用。

2.6 TGF-β、MCSF和C反应蛋白(CRP)促进单核细胞亚群分化严重创伤患者单核细胞CD14highCD16+亚群明显扩增，且与创伤血清中高水平的TGF-β、MCSF和CRP密切相关。通过健康志愿者单核细胞与创伤血清共培养，结合血清中细胞因子抗体中和实验，证实创伤血清中高浓度的TGF-β和MCSF是激活并诱导单核细胞分化为高表达CD14和CD16亚群的主要细胞因子。而创伤急性期外周血清中高水平CRP则可作用于单核细胞的CD16(CD16被认为是CRP的受体)，促进CD14highCD16+亚群产生抗炎细胞因子，后者介导了创伤后的免疫抑制状态［3］。

3 创伤/烧伤后单核－巨噬细胞功能失衡的逆转措施

3.1 普萘洛尔 肾上腺素能受体阻断剂－普萘洛尔已被证实可改善严重烧伤机体的高代谢状态。Muthu等［22］进一步发现烧伤小鼠的交感神经兴奋性增加，进而促进单核细胞的生成以及巨噬细胞释放细胞因子。其中高表达F4/80+Grl+的小鼠巨噬细胞属于炎性表型，烧伤后给予普萘洛尔可减少因烧伤诱导的炎性单核细胞的增多，同时增加粒细胞数量，进而改善了烧伤后粒细胞和炎性单核细胞的炎症应答能力。

3.2 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)刘继松等［23］通过临床对比研究发现外用rhGM-CSF凝胶剂与单纯凝胶剂基质相比能够促进深Ⅱ度烧伤创面坏死组织的脱落，加快创面愈合。其可能机制为:(1)rhGM-CSF可趋化血液中的中性粒细胞和单核细胞迁移至创面，并活化其功能，表现为增强中性粒细胞、巨噬细胞的氧化代谢，上调巨噬细胞数量，增强其吞噬及分泌功能，利于自身清除创面的坏死组织和细胞碎片，使创面坏死组织脱落。(2)rhGMCSF可通过激活的炎性细胞释放各种蛋白酶，以促进烧伤创面坏死组织的分解和脱落。许多研究已证实壳聚糖通过调节中性粒细胞与巨噬细胞来促进烧伤创面的愈合。

3.3 雌激素 Hsieh等［15］报道，雌激素体内应用可通过增加创伤失血动物Kupffer细胞的Akt磷酸化水平，维持其Fc受体及ATP含量，进而逆转其受抑的吞噬能力，并使其外周血清中升高的TNF-α、IL-6和IL-10水平趋于正常。相反，同时应用雌激素受体拮抗剂ICI 182，780、PI3K抑制剂Wortmannin则可消除雌激素的上述保护效应。

3.4 兴奋迷走神经 提高迷走神经兴奋性旨在增加迷走神经信号输出，改变免疫细胞的炎性调定点，调整损伤后的炎性应答。Lopez等［4］在观察到烧伤小鼠体内腹腔巨噬细胞处于高活化状态的同时，尝试兴奋迷走神经对其干预效应。发现兴奋烧伤组小鼠迷走神经可有效降低巨噬细胞在LPS刺激下的p65Ser536磷酸化水平，进而确定了迷走神经兴奋对阻断腹膜巨噬细胞活化减轻炎症反应具有保护作用。探究迷走神经信号通路在抗炎中的作用已经显示出极大的临床可行性。

3.5 siRNA策略 通过对烧伤小鼠粒细胞单核细胞前体细胞(GMP)来源的单核细胞进行siRNA转染以沉默MafB表达，则可提高GATA-1表达水平并部分恢复烧伤动物的单核细胞向树突状细胞分化的能力［6］。

4 展望

深入研究创伤/烧伤后单核－巨噬细胞功能紊乱的分子机制对于开发新型免疫调节策略无疑具有重要的临床意义。但目前临床上对于伤后单核－巨噬细胞数量及功能监测多采用外周血单核细胞，而对机体巨噬细胞的功能监测因取材困难常不能实施。事实上巨噬细胞的异质性决定了不同部位的巨噬细胞在伤后表现为不同的变化特征，而外周血中单核细胞功能的监测结果只能反应单核-巨噬细胞功能的一个侧面。加之创伤后的不同阶段可致单核－巨噬细胞发生由“激活”到“失活”、由“促炎”向“抗炎”的转变，从而使得临床上单方面实施“免疫抑制”或“免疫增强”策略变得无所适从。目前对创伤/烧伤后单核-巨噬细胞功能变化的分子机制研究尚不够深入，故相应的调节措施存在着“逆转某一个或几个指标变化”的局限性。推测未来的发展趋势可能包括以下几个方面:(1)研发新型的免疫检测手段，以全面、客观、适时地反映机体伤后的免疫应答水平;(2)应用现代免疫学及分子生物学新技术揭示创伤后免疫功能紊乱的精细调节机制;(3)以是否能改善伤者预后(如降低伤后脓毒症及多器官功能衰竭发生率)及提高生存率为标准来评估免疫调节策略的有效性。相信随着研究的深入，创伤/烧伤后单核-巨噬细胞功能失衡的分子机制将不断被揭示，新型有效的免疫调节策略将不断被发掘。

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