膀胱癌特异性核基质蛋白-4在膀胱癌研究中的进展

李博科 王东文

·综述·

膀胱癌特异性核基质蛋白-4在膀胱癌研究中的进展

李博科 王东文

膀胱癌是我国泌尿外科临床上最常见的恶性肿瘤。根据肿瘤对膀胱壁的浸润深度，可分为非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌。近70%的患者为非肌层浸润性肿瘤，膀胱癌整体5年生存率可达77%，仅5.5%的患者出现远处转移[1]。但由于膀胱癌具有较高的复发率，肿瘤恶性程度可伴随复发、逐渐进展等特点，使膀胱癌远期预后不佳[1]。低、中风险的膀胱癌患者在行经尿道膀胱肿瘤电切术后1年分别有20%、40%的复发率，高风险患者复发率可达90%[2]。膀胱癌的早期诊断和预后监测是治疗的核心。长期以来，膀胱镜活检一直作为早期诊断、术后随诊和预后监测的金标准。为了提高无创检测膀胱癌的水平，尿膀胱癌标志物的研究受到了很大的关注，美国食品药品管理局(FDA)已批准膀胱肿瘤相关抗原测定(BTAstat；BTAtrak)、核基质蛋白(NMP)22、纤维蛋白降解产物(FDP)、免疫细胞化学检测(ImmunoCyt)和荧光原位杂交(FISH)用于膀胱癌的检测。多项研究显示FISH技术具有较高的敏感性和特异性[3-6]，目前已有多种商品化的FISH试剂盒用于临床。但对于有膀胱炎症、结石、放疗等病史者的尿液标本，反应性脱落细胞可能造成FISH结果的特异性降低[7]。Hajdinjak[8]选用FISH技术检测尿液中脱落细胞染色体3、7、17和9p21的突变情况，Meta分析结果显示，FISH诊断膀胱癌总体敏感度为72%，特异度为83%，ROC曲线下面积为0.867。一项前瞻性研究结果显示，FISH检测可用于非肌层浸润性膀胱癌的复发预测，其中9p21缺失可作为膀胱癌复发的独立预测因子，预测复发的敏感度为45.6%，特异度为85.3%[9]。然而，FISH阳性的评判标准目前尚未统一，对检查员的技术要求高，检查耗时较长，且并非所有膀胱癌细胞的染色体都会呈现3、7、17或9p21的突变[10]。膀胱癌特异性核基质蛋白-4(bladder cancer specific nuclear matrix protein-4, BLCA-4)是一种无创性、高敏感度、高特异度的膀胱肿瘤检测指标，具有广阔的应用前景，现对其在膀胱癌研究中的进展作一总结。

一、BLCA-4的发现和生物学特性

核基质是细胞核的框架，是细胞核内除去核仁、核膜、核纤质和染色质以外的纤维蛋白网架体系。其主要成分为蛋白质和RNA，功能除了维持细胞核形态以外，还参与基因转录加工、染色体的分配等重要的核内反应[11]。

NMP：1974年Berezney和Coffey[12]首先报道了NMP，NMP是细胞核的网状骨架，约占全部核蛋白的10%，主要成分是纤维蛋白，不含脂质、DNA和组蛋白。NMP在维持细胞核的形态结构、染色体组装、DNA复制和RNA转录等一系列活动中发挥重要作用。许多恶性肿瘤机体均发生NMP成分及结构的变化，因此其可作为检测恶变的指标。NMP在不同的细胞及组织中，包括正常及肿瘤组织中显示出一定的特征性及差异性[13]，这为筛选癌症相关的特异性分子标志物提供了可能。其中NMP22是美国FDA第一个批准用于膀胱癌监测的NMP，已经在美国商品化应用数年时间。但其检测结果受血尿、尿路感染、尿液浓缩等因素影响较大[14]。随着对NMP越来越多的研究，发现BLCA-4是具有潜在临床应用前景的膀胱肿瘤标志物。

Getzenberg等[15]于1996年首次通过双向凝胶电泳法，对17例膀胱癌患者的癌组织和正常人膀胱组织进行对比研究分离出9种膀胱NMP，其中有6种仅在膀胱癌组织中表达，而在正常人膀胱组织中不表达，这6种膀胱癌NMP分别命名为BLCA-1、2、3、4、5、6。另外3种仅存在于正常的膀胱组织而癌组织中不表达，分别命名为BLNL-1、2、3。对膀胱癌细胞系253j、UMUC-2 和T24的研究发现，BLCA-1、2、3、4、6存在于3种癌细胞系中，仅BLCA-5不存在这些癌细胞系中。同样BLNL-1、2、3也不存在上述膀胱癌细胞系中。NMP在细胞死亡后被释放出来，以可溶性的复合物或片段(相对分子量为30 000左右)的形式存在于人的尿液中[16]，BLCA-4在正常膀胱组织中不表达而存在于膀胱癌组织中，所以尿中检测出BLCA-4可以提示膀胱癌的存在。

二、BLCA-4在膀胱癌筛选和诊断中的研究

2000年Konety等[17]利用免疫印迹法检测了12例病理结果确诊为膀胱癌患者的癌组织、相邻“正常”组织及11例病理结果排除膀胱病变的正常人膀胱组织中BLCA-4的水平，结果发现BLCA-4在膀胱癌患者癌组织及相邻“正常”组织均有表达。12例膀胱癌患者的“正常”组织BLCA-4水平全部阳性，癌组织中有9例阳性(剩余3例在过度曝光后呈现低表达)，11例正常人膀胱组织BLCA-4水平均未表达(在印迹分析中过度曝光也未表达)。并且发现BLCA-4表达与肿瘤分期相关，然而再用ELISA检测尿BLCA-4表达则与肿瘤分期没有相关性。同时，他们用免疫测定法，分析了55例膀胱癌患者尿液样本和51例正常人尿液样本，结果发现55例膀胱癌患者中有53例尿液中BLCA-4阳性，灵敏度96.4%(95%置信区间：87.5%～99.6%)，51例正常人尿液中BLCA-4均为阴性，特异度100%(95%置信区间：93%～100%)。认为BLCA-4存在于膀胱癌患者的癌组织和“正常”组织，并且BLCA-4是一项高敏感度、高特异度的膀胱癌尿液标志物，可运用于膀胱癌的筛选和早期诊断。

同年，Konety等[18]对51例正常对照受试者、55例膀胱癌患者和202例脊髓损伤患者的尿液通过免疫测定法检测BLCA-4水平，评估了在脊髓损伤患者中BLCA-4水平与泌尿系感染、吸烟、留置尿管、膀胱炎的关系。结果表明51例正常对照者的尿液BLCA-4水平均低于临界值(临界值设为每微克蛋白13 OD)，55例膀胱癌患者中有53例尿液BLCA-4水平高于临界值，202例脊髓损伤患者中有38例尿液BLCA-4水平高于临界值。Konety等认为尿液中BLCA-4水平的过表达有助于对普通人群和高危群体中进行膀胱肿瘤的筛选和诊断，且尿液中BLCA-4水平与泌尿系感染、吸烟、留置尿管、膀胱炎均无相关性。

2010年，国内孙忠全等[19]根据当时已确定的BLCA-4的特异氨基酸片段序列：羟基端-EISQLNAGAC-氨基酸[17]，进行多肽合成，将多肽用Imject Immunogen EDC Conjugation Kit耦联KLH作为抗原，用杂交瘤细胞制备了BLCA-4单克隆抗体，利用得到的纯化抗BLCA-4单克隆抗体检测15例膀胱癌标本，癌组织、癌旁组织、正常尿路上皮组织BLCA-4阳性表达分别为14、13和0例，敏感度和特异度分别为93.3%和100%。由于检测BLCA-4的抗体多为多克隆抗体，而单克隆抗体的制备将使BLCA-4的检测结果更准确，特异性更高，为进一步研究提供了实验基础。

2011年，Feng等[20]为了探讨BLCA-4在检测我国汉族膀胱癌患者尿液的可行性，对我国汉族79例膀胱癌患者、31例尿路感染患者和29例正常对照者的尿液通过ELISA法逐一分析，结果显示尿液BLCA-4水平在膀胱癌组显著高表达且高于其他两组，其表达水平与年龄、性别、生长模式无关，敏感度为97.37%，特异度为100%，并且发现BLCA-4水平在肌层浸润性膀胱癌患者中要高于非肌层浸润性膀胱癌患者。同时利用免疫组化法检测53例膀胱癌组织、24例病理正常的癌旁组织和15例正常对照膀胱组织标本的BLCA-4水平，肿瘤组织中BLCA-4有较高得分的染色，癌旁组织有41.67%发现BLCA-4阳性，中国汉族正常膀胱组织中BLCA-4水平均为阴性。Feng等认为BLCA-4存在于患者的组织和尿液中，通过检测尿液BLCA-4水平诊断膀胱肿瘤是一种高灵敏度、高特异度的检测方法，故BLCA-4在中国汉族膀胱癌人群中也有潜在的应用价值。

2014年，Xia等[21]通过检索PubMed、EmBase(涵盖1974年至今)和CBM(涵盖1966年至今)数据库，进行了一项Meta分析，共有7篇文献纳入，纳入研究对象877例，其中病例组312例，对照组565例，所有纳入研究均使用ELISA法进行BLCA-4的测定，结果显示BLCA-4检测的敏感度为0.85(95%置信区间：0.81～0.88)，特异度为0.97(95%置信区间：0.95～0.98)，拟合BLCA-4的SROC曲线下面积为0.980 6，表明尿BLCA-4水平的检测可以作为一种快速、简便、无创的膀胱癌筛查方法。

为了探讨BLCA-4在浸润性膀胱癌血液中的表达情况，王晓鹏[22]采用 ELISA 法检测 BLCA-4在实验组(72 例浸润性膀胱癌患者的血液、尿液和膀胱组织)、对照组(包括 78 例前列腺增生患者的血液、尿液和膀胱组织，44 例体检正常者和 34例泌尿系结石患者的血液和尿液)中的水平及表达情况。结果显示实验组浸润性膀胱癌患者尿液中BLCA-4含量中位数为1.593，增生组含量为0.319，结石组含量为0.238，正常组为0.194 ，浸润性膀胱癌患者尿液中BLCA-4 蛋白含量显著高于其他3组(P<0.05)；而实验组浸润性膀胱癌患者血清中BLCA-4含量中位数为5.808，增生组、结石组、正常组血清中BLCA-4的含量分别为5.718、5.076、4.995，差异无统计学意义(P>0.05)。

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三、BLCA-4在膀胱癌预后中的研究

2012年，Zhao等[23]研究评估了BLCA-4的组织表达与膀胱癌患者预后的关系，通过免疫组化法检测了325例膀胱癌患者组织标本BLCA-4水平，结果显示254例(78.2%)表达阳性，178例(54.8%)表达强阳性，发现BLCA-4的过表达与肿瘤的分级、分期密切相关，但未发现与患者的性别、年龄、肿瘤大小及数目相关。使用Kaplan-Meier法和Cox比例风险模型评估生存分析，多变量分析显示BLCA-4是预测膀胱肿瘤患者总体生存率的独立影响因子，其高表达导致了膀胱癌患者较差的预后。Zhao等认为BLCA-4可能成为膀胱癌预后的重要标志物。

为了进一步研究BLCA-4在膀胱癌患者术后监测肿瘤复发中的意义，蒋民军等[24]采用ELISA法，对20例无泌尿系统疾病史的健康志愿者、30例泌尿系统良性病变(如膀胱炎、前列腺增生、膀胱结石等)患者及30例病理诊断为尿路上皮癌的初发膀胱癌患者术前和术后1、6个月和1年尿液中BLCA-4的表达进行分析。结果显示，以450 nm波长测量吸光度值，BLCA-4值>13.00 A/μg protein为临界参考值，健康对照组尿液中BLCA-4表达值的中位数为0.97 A/μg protein，良性病变组尿液中BLCA-4表达值的中位数为2.19 A/μg protein，膀胱癌患者尿液中BLCA-4表达值的中位数为39.48 A/μg protein，膀胱癌组与健康对照组、良性病变组比较差异均有统计学意义，而健康对照组和良性病变组之间差异无统计学意义。此外，膀胱癌组有2例术前均诊断为膀胱癌T1期，行经尿道膀胱肿瘤等离子切除术，病理诊断分别为低度恶性倾向尿路上皮乳头状肿瘤和低分级尿路上皮癌，术后1个月和6个月时尿液中BLCA-4表达均降至17 A/μg protein以下，而术后1年时尿液中BLCA-4表达值分别为98.52 A/μg protein和128.79 A/μg protein，较同期患者明显升高，当时影像学及膀胱镜检查均未见异常，术后15个月时经膀胱镜和影像学检查证实肿瘤复发。故认为BLCA-4可作为监测膀胱癌术后复发的标志物之一，先于膀胱镜和影像学检查预测复发，但需要加大样本量及加强随访密度时间以获得更有信服力的统计学结果。

2013年Ji等[25]通过PCR和焦磷酸测序法对血液中白细胞DNA的总体低甲基化测定，检测是否与膀胱癌的风险有关。312例膀胱癌患者和361名健康对照者入选实验。结果显示膀胱癌组的中位甲基化水平(75.7% 5mC)明显低于对照组(79.7% 5mC)。初步探讨了在人血液中白细胞DNA的BLCA-4重复区域的总体低甲基化水平，会增加膀胱癌的风险，并提出了BLCA-4低甲基化对于膀胱癌预后不良的患者可能是有价值的生物学标志物。

四、BLCA-4作用机制及靶向治疗的研究

为了研究BLCA-4的可能作用机制，Feng等[26]对53例膀胱癌患者组织标本进行了BLCA-4水平的免疫组化染色，探讨了其与基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素-1α(IL-1α)、IL-8、色素上皮衍生因子(PEDF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及血管性假血友病因子在膀胱癌表达的相关性。结果发现BLCA-4的表达与IL-1α、IL-8、VEGF、MMP-9存在正相关，与PEDF、TNF-α、MVD不存在相关性。结果表明，BLCA-4未必在膀胱癌的促血管生成机制中起作用，但会与IL-1α、IL-8、VEGF、MMP-9相互作用，提高肿瘤的发生和侵袭。

五、结论和展望

膀胱镜活检仍是膀胱癌诊断和预后监测的“金标准”，但对于早期或肉眼不可见的病变易遗漏，导致疾病的进一步发展，威胁患者健康及生活质量。BLCA-4可作为肿瘤标志物，以其高敏感性、高特异性、无创性用于普通人群和高危群体的筛选、早期诊断和预后监测，弥补膀胱镜检查中漏诊及有创的不足。

经总结后发现BLCA-4的研究有以下几方面值得关注：①BLCA-4在正常人膀胱组织中未见表达，在膀胱癌组织和癌旁组织可见表达，因此可作为膀胱癌分子诊断的良好靶标。②BLCAs的其余成员在膀胱癌研究中的角色还不明确，有待进一步研究。③尿液中BLCA-4检测的可重复性和标准化建立还不完善。④膀胱癌患者术后灌注前后BLCA-4的表达变化未见报道。⑤研制基于BLCA-4的光敏剂，对于早期发现病变部位，提高术中膀胱肿瘤电切的质量，尽可能完全清除肿瘤的原发病灶具有一定临床研究前景。

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(本文编辑：熊钰芬)

·THP专栏·

吡柔比星膀胱灌注评估肿瘤组织药物浓度和暴露时间或疗效的关系

〔ArakawaM, et al. Exp Ther Med,2011,2(5):901-905〕

本项研究评估蒽环类药物吡柔比星(THP)TURBT术后即刻单次膀胱灌注用于治疗浅表性膀胱癌时，局部组织中药物浓度和暴露时间或疗效的关系。

研究入组22例浅表性膀胱癌患者(中低危)经单次膀胱灌注THP(30 mg)治疗，间隔一定时间后检测肿瘤组织和血液中THP的浓度。在膀胱癌肿瘤组织中可以检测到不同浓度(范围：2.3～125 μg/g组织)THP，而在血液中没有检测到THP。

在30 min内，肿瘤组织中THP的浓度随着暴露时间延长而增加，而与肿瘤大小相关性小。TURBT术后肿瘤膀胱灌注THP，没有发现组织浓度与预防术后膀胱内复发存在显著的相关性。所有患者均没有发现与THP治疗相关的严重不良反应，如膀胱刺激征、局部毒性等。

本研究提示，对于浅表性膀胱癌患者，在膀胱灌注THP时，应该考虑药物暴露时间和肿瘤大小的影响。肿瘤组织药物浓度随着暴露时间的延长而增加，30 min达到最大浓度。

(深圳万乐药业有限公司学术部摘译)

030001太原，山西医科大学第一医院

王东文，E-mail:urology2007@126.com

10.3870/j.issn.1674-4624.2015.06.016

2015-06-16)