贵州省3个少数民族HLA-G基因14 bp插入/缺失的多态性研究*



贵州省3个少数民族HLA-G基因14 bp插入/缺失的多态性研究*

网络出版时间：2015-03-19网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.0946.011.html

何燕， 赵孝梅， 左娅， 张婷， 邓婕， 吴昌学， 禹文峰， 官志忠**

(贵阳医学院 分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 了解贵州省3个少数民族(布依族、水族、苗族)群体人类白细胞抗原-G(HLA-G)基因14 bp插入/缺失多态性的分布规律及其与遗传背景之间的关系。方法： 采用PCR扩增、电泳及测序的方法对来自贵州地区的布依族、水族、苗族共344例健康个体DNA进行HLA-G基因14 bp插入/缺失多态性检测，并与文献报道的仡佬族、壮族等13个民族群体的HLA-G基因14 bp插入/缺失多态性分布数据进行对比。结果： 布依族、水族和苗族人群的+14 bp等位基因频率分别为23.7%、26.0%和38.1%，+14 bp/+14 bp基因型频率分别为9.40%、10.4%和15.9%，14 bp插入频率比较示布依族和苗族差异有统计学意义(χ2=11.345，P=0.001)，苗族与水族差异有统计学意义(χ2=6.125，P=0.009)而布依族和水族间比较差异无统计学意义(P>0.017)；与其他人群数据比较，苗族群体的14 bp插入/缺失分布与其他人群相似，而作为壮侗语族的布依族、水族则有自己独特的14 bp插入/缺失分布规律。结论： 布依族、水族人群的14 bp插入/缺失分布相似，但是与苗族人群的分布存在一定的差异。

[关键词]基因，HLA-G; 14 bp插入/缺失多态; 布依族; 水族; 苗族；贵州

人类白细胞抗原-G(HLA-G)是非经典的HLA I类分子，位于6号染色体HLA-A端粒侧。HLA-G基因的多态性水平较其它经典的HLA I类分子低，目前研究最多的是14 bp插入/缺失等位基因多态性。14 bp插入/缺失多态性与各种原因引起的复发性流产、重度子痫前期、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮及一些慢性炎症性疾病等的发病及进展有关[1-6]。HLA-G基因14 bp插入/缺失的多态性不仅与种族有关，还与民族起源相关[7-8]。遗传背景会影响基因频率在群体中的分布，而遗传背景不同所造成的群体分层现象会导致一些研究(尤其是病例-对照研究)中假阳性结果的出现[9-11]。本文选择同为汉藏语系的布依族、水族和苗族为研究对象，检测该群体健康个体的14 bp插入/缺失多态性分布频率，并结合文献，与仡佬族、壮族、傣族、毛南族、布朗族、佤族、基诺族、哈尼族、土族、裕固族、怒族、云南汉族、浙江汉族共13个民族群体进行对比，分析14 bp插入/缺失多态性和群体遗传背景的相互关系。

1对象与方法

1.1　研究对象

根据知情同意原则，采集贵州省3个少数民族(布依族、苗族、水族)群体共344例健康无亲缘关系个体外周血2~5 mL，用于HLA-G基因14 bp插入/缺失多态性分析。采样时，追溯采血对象3代以上均为本民族，以保证其代表性。

1.2　HLA-G基因14 bp插入/缺失多态性检测

采用QIAGEN外周血DNA提取试剂盒提取DNA，DU640型核酸蛋白分析仪测定DNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性，样品DNA稀释至100 mg/L，-20 ℃保存备用。用Primer Premier 5.0 软件设计PCR引物，上游系列为5′-CCCTCACTGTGACTGATATG-3′，下游系列为5′-CAAAGAGGAGTCAGGGTTC-3′。 25 μL PCR扩增体系组成为10×buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，4×dNTP(每种2.5 mmol/L)2.0 μL，TaqDNA聚合酶1.25 U，10 μmol/ L上下游引物各1 μL，模板DNA 100 ng。PCR扩增条件为：94 ℃变性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，30次循环。PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳及溴化乙啶染色后在凝胶成像仪上检测并记录结果。

1.3　数据统计

计数该群体的基因型频率和相应的等位基因频率，用Pypop0.7.0软件对各群体进行Hardy-Weinberg平衡检验(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)，群体间等位基因频率比较用SPSS 17. 0软件进行χ2检验。

2结果

2.1　14 bp插入基因型判定

扩增产物为134 bp的单一条带，基因型为14 bp插入型纯合子(+14 bp/ +14 bp)；扩增产物为106 bp单一条带的为14 bp缺失型纯合子(-14 bp/-14 bp)；两种条带均有为杂合子(+14 bp/-14 bp)，如图1。扩增的产物经纯化后测序，并将结果在NCBI Blast中进行比对，结果显示插入的14 bp片段的基因序列为ATTTGTTCATGCCT，且该序列与HLA-G基因的Exon8的序列一致，说明本研究的分型方法可靠，见图2。

注：M为DNA MarkⅠ，1、3、4、5、9、13为杂合子(+14 bp/-14 bp)，2、6、7、8、11为缺失型纯合子(-14 bp/-14 bp)，10、12为插入型纯合子(+14 bp/+14 bp) 图1　HLA-G基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.1　The agarose gel electrophoresis figure of HLA-G gene PCR products

2.2　民族群体中HLA-G 14 bp插入/缺失的等位基因、基因型频率和Hardy-Weinberg平衡检验

注：左图为含14 bp插入的基因序列图，插入的14 bp序列为ATTTGTTCATGCCT；右图为14 bp缺失的基因序列图，如图箭头所指出为14 bp缺失的位置图2　HLA-G基因Exon8 PCR扩增产物测序图Fig.2　Sequence figures about the PCR products of the HLA-G gene Exon8 region

3个民族(布依族、苗族、水族)群体的14 bp插入(+14 bp)等位基因频率分别为0.237、0.381、0.260；+14 bp/-14 bp基因型频率分别为0.381、0.443、0.313；-14 bp/-14 bp基因型频率分别为0.525、0.398、0.583；+14 bp/+14 bp基因型频率分别为0.094、0.159、0.104； Hardy-Weinberg 平衡检验结果显示3个群体基因型频率均符合Hardy- Weinberg 平衡，说明样品具有代表性。见表1。

表1　不同民族群体HLA-G 基因14 bp插入/缺失基因型、等位基因频率及Hardy-Weinberg检验

2.3　HLA-G基因14 bp插入频率

3个民族群体HLA-G基因14 bp插入频率的比较采用χ2检验，结果经Bonferroni校正后，取P<0.017为差异具有显著的统计学意义。结果显示布依族和苗族差异有统计学意义(χ2=11.345，P=0.001)；苗族与水族差异有统计学意义(χ2=6.125，P=0.009)而布依族和水族间比较差异无统计学意义(P>0.017) 。见表2。

2.4　16个不同语族的民族群体的HLA-G 14 bp插入/缺失频率

结合已有报道的仡佬族、壮族、傣族、毛南族、布朗族、佤族、基诺族、哈尼族、土族、裕固族、怒族、云南汉族、浙江汉族共13个民族群体的HLA-G14 bp插入/缺失多态性分布数据[12-15]，将16个民族群体按语系语族的不同分为6组，见表3。再对这6个组进行14 bp插入频率的χ2检验，结果经Bonferroni校正后，取P<0.003 3为差异具有统计学意义。结果显示汉藏语系壮侗语族与其余5个语族之间两两比较差异有统计学意义(P<0.003 3)，汉藏语系藏缅语族与汉藏语系汉语支比较差异有统计学意义(P=0.001)，其余各组间比较差异无统计学意义(P>0.003 3)，见表4。

表2　3个民族群体的14 bp插入频率

注：P<0.017为有显著性差异，括号中数字代表所选择的该民族群体中所含的个体数

表4　6个不同语族群体HLA-G基因14 bp插入等位基因频率

注：P<0.003 3为差异有统计学意义

3讨论

我国是一个多民族国家，历史悠久，各民族都形成了自己的民族文化和生活习俗。少数民族人口虽少，但分布很广。由于地理环境和历史发展的原因，多数少数民族仍然居住在较封闭的环境中，成为一个遗传学上相对隔离的群体，所以少数民族群体的遗传背景相对单纯，这对进行人类遗传多样性分析以及遗传疾病基因定位研究具有一定的优势[12-15]。

本研究选取贵州省黔东南地区的布依族、水族、苗族3个同为汉藏语系的民族进行HLA-G基因14 bp插入/缺失的χ2配对比较，结果显示苗族14 bp插入频率分别与布依族、水族比较差异有统计学意义，而布依族和水族之间则无统计学意义。原因可能是布依族和水族同为汉藏语系壮侗语族，都是由古代的“百越”族群发展而来，多居于贵州黔南一带，两个群体遗传背景相似；而苗族属于汉藏语系苗瑶语族，在发展过程中由于多方面的原因导致其与布依族、水族之间遗传背景存在一定的差异[12]。因此，可以认为HLA-G基因14 bp插入频率可能因语族不同而有所差异，这与Tao Y等的研究结果相吻合。

本研究对来自6个不同语族群体的16个少数民族群体的HLA-G基因14 bp插入/缺失多态性进行研究，结果表明：(1)在汉藏语系当中缅藏语族14 bp插入频率(0.405～0.534)最高，其次是汉语族(浙江汉族和云南汉族，0.403～0.408[13-14])和苗瑶语族(苗族，0.381)，最低是壮侗语族(壮族、傣族、布依族、水族、毛南族、仡佬族，0.260～0.344[8,12-13])；各语族之间比较14 bp插入频率，苗瑶语族(0.381)与汉语族(0.403～0.408)接近，均低于缅藏语族(0.405～0.534)，同时该3个语族14 bp插入频率均高于壮侗语族(0.260～0.344)差异有统计学意义。(2)作为阿尔泰语系蒙古语族的土族、裕固族14 bp插入频率(0.376～0.446)[15]与南亚语系孟高棉语族的布朗族、佤族(0.470～0.609)接近；且均高于汉藏语系各语族，但只与壮侗语族(0.260～0.344)差异有统计学意义。根据如上的结果可以看出HLA-G基因14 bp插入频率具有语系及语族的分布特点[15]。汉族群体14 bp插入频率与苗族群体、阿尔泰语系蒙古语族群体、南亚语系孟高棉语族群体均接近，原因可能是随着时代的发展，人们思想观念逐渐开放、经济条件日益好转、交通设施逐渐完善，使得各民族之间的交流逐渐增多，形成了一个“大杂居，小聚居”的局面，进一步地促进各民族之间的交流与融合。有研究者指出岭南和西南地区的越人，有的较早与汉族融合，已经逐渐演变形成今天的一些兄弟民族，这些兄弟民族就是属于汉藏语系壮侗语族的各民族[16]。经过数百年的演变，百越与外族的交流融合已经是一个非常复杂的过程，既有外族成分融入百越，又不断有百越的成分流向外族，这使得百越族演变而成的这些民族群在不断的演变与进化过程中形成了自己独特的遗传背景，这可能是壮侗语族14 bp插入频率较本研究中提到的其余语族群体较低的一个原因。

本研究结果显示3个少数民族群体(布依族、水族、苗族)的基因型和等位基因分布与其他群体的分布有相同的趋势，在同一研究群体中基因型(+14 bp/+14 bp)频率和+14 bp等位基因频率都较低。与其它群体数据比较发现，苗族群体14 bp插入/缺失的分布与其他群体相似，而布依族和水族则有自己独特的等位基因和基因型分布规律，推测可能与其独特的遗传背景相关。

参考文献4

[1]Tripathi P, Abbas A, Naik S, et al．Role of 14-bp deletion in the HLA-G gene in the maintenance of pregnancy ．Tissue Antigen, 2004(6):706-710．

[2]邵剑春, 胡大春, 陈俊. HLA-G 14 bp基因多态性及HLA-G mRNA表达水平与原因不明复发性流产的关系. 实用妇产科杂志, 2011(9):698-701.

[3]张展, 王婧彦, 张琳琳, 等. 人类白细胞抗原G基因14 bp缺失多态性与重度子痫前期发病的关系. 中华妇产科杂志, 2010(5):348-352.

[4]涂频, 张新华, 周航波, 等. 溃疡性结肠炎和克罗恩病的临床病理特征及HLA-G在其鉴别诊断中的应用. 诊断病理学杂志, 2008(3):165-168.

[5]吴凤霞, 武丽君, 罗雄燕, 等. 人白细胞抗原G14 bp插入/缺失多态性和血浆可溶性人白细胞抗原G表达水平与系统性红斑狼疮的相关性研究. 中华临床医师杂志, 2010(2):144-149.

[6]徐丹萍, 林爱芬, 颜卫华. HLA-G与慢性炎症性疾病的研究进展. 中华微生物学和免疫学志, 2014(7):554-559.

[7]马薇, 周昌菊. HLA-G多态性在生殖领域的研究进展. 国际病理科学与临床杂志, 2006(3):259-262.

[8]Tao Y, Chen J, Yao Y, et al. Distribution of HLA-G-14 bp insertion /deletion polymorphism in six Chinese ethnic groups. Int J Immunogenet, 2013(2):93-98.

[9]Price AL, Zaitlen NA, Reich D, et al. New approaches to population stratification in genome-wide association studies. Nat Rev Genet, 2010(7):459-463.

[10]McEvoy BP, Montgomery GW, McRae AF, et al．Geographica structure and differential natural selection among North European population. Genome Res, 2009(5):804-814.

[11]Ripa J, Dieckmann U. Mutant invasions and adaptive dynamics in variable environments．Evolution, 2013(5):1279-1290.

[12]孙倩倩, 黎明, 孙良先, 等. 水族和仡佬族HLA-G基因14bp插入/缺失多态性与其遗传背景的相互关系. 中国优生与遗传杂志, 2013(21):11-14.

[13]陈金宝, 史磊, 姚宇峰, 等. 云南傣族、汉族 HLA-G 基因 14 bp 插入/缺失多态性研究. 遗传, 2010(6):577-582.

[14]Yan WH, Lin A, Li M, et al. Analysis of the 14 bp insertion and deletion polymorphism in Human leukocyte antigen-G gene in two Chinese ethnic populations. Tissue Antigens, 2008(3):227-233.

[15]张华, 陶玉芬, 史磊, 等. 中国4个民族群体HLA-G基因14 bp插入/缺失多态的分布特征及其HLA-A位点的相关性. 遗传, 2013(2):161-167.

[16]李月英.百越族系民族及其文化特征.今日民族, 2007(12):30-34.

(2015-01-09收稿，2015-02-25修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 周凌

·专题研究·

Analysis of the 14 bp Insertion/Deletion Polymorphism in Human

Leukocyte Antigen-GGene in Chinese Buyi, Shui,

and Miao Ethnic Groups in Guizhou Province

HE Yan, ZHAO Xiaomei, ZUO Ya, ZHANG Ting, DENG Jie, WU Changxue, YU Wenfeng, GUAN Zhizhong

(TheKeyLaboratoryofMolecularBiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the distribution of HLA-G gene 14 bp insertion /deletion polymorphism in Buyi, Shui and Gelao populations and their relationship with genetic background．Methods:PCR amplification, agarose gel electrophoresis and sequencing were used to explore the distribution of 14 bp insertion/deletion in HLA-G gene in 344 healthy people of these three ethnic groups, and the data were compared with that of 13 ethnic groups such as Gelao, Zuang reported in the literature. Results: The frequencies of +14 bp in Buyi, Shui and Miao were 23.7%, 26.0% and 38.1% respectively. The genotype frequencies of +14 bp/+14 bp in Buyi,Shui and Miao were 9.40%, 10.4% and 15.9% respectively. The differences of 14 bp insertion frequencies between Buyi and Miao, between Miao and Shui were statistically significant (P<0.05), while no significant difference was found between Buyi and Shui (P>0.05). When compared with other groups, the distribution characteristic of +14 bp insertion/deletion in Miao was similar to them, but Buyi and Shui showed significance difference from others. Conclusion: The distribution characteristics of +14 bp insertion/deletion in Buyi is similar to Shui, but they are different from that of Miao.

[Key words]gene,HLA-G; +14 bp insertion/deletion polymorphism; Buyi people; Shui people; Miao people； Guizhou

[中图分类号]R394；R34-33； RZ273

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2015)03-0217-05

通信作者**E-mail:zhizhongguan@yahoo.com

[基金项目]*国家“十二·五”科技支撑计划项目(No：2013BAI05B03)； 贵州省科技厅社会发展攻关项目：SY(2012)3135]