荔波少数民族人群HBV感染与ESRα基因Pvu Ⅱ和T29C位点基因多态性研究*



荔波少数民族人群HBV感染与ESRα基因PvuⅡ和T29C位点基因多态性研究*

网络出版时间：2015-03-19网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.0943.010.html

左娅**， 何燕***， 赵孝梅， 张婷， 王婵娟， 禹文峰， 官志忠

(贵阳医学院 分子生物学重点实验室, 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 了解贵州荔波少数民族人群雌激素受体(ESRα)基因PvuⅡ位点和T29C位点多态性与乙型肝炎病毒 (HBV)易感性的关系。方法： 选取贵州荔波县少数民族健康对照91例和HBsAg携带者80例，采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性 (PCR-RFLP)方法测定受检者基因组中ESRα基因PvuⅡ和T29C位点多态性，分析两位点多态性与HBV易感性的关系。结果： 在荔波少数民族健康对照组和HBsAg携带组中均检出ESRα基因PvuⅡ和T29C位点3种基因型，但3种基因频率和等位基因频率在两组间分布差异无统计学意义(P>0.05)。结论： ESRα基因的PvuⅡ和T29C基因多态性与荔波少数民族人群中乙肝感染无关。

[关键词]少数民族； 基因，雌激素受体； 乙型肝炎； 携带者； 感染； 多态性； 贵州荔波

全球约有4亿人为乙型肝炎病毒 (HBV)携带者，每年约有25万人死于慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌[1-3]。HBV感染的慢性化是一个多因素的结果，除与HBV的变异、宿主的年龄、性别和免疫状态等有关外，机体遗传基因的多态性可能也是导致HBV感染慢性化的另一个重要原因[4]。雌激素主要通过与雌激素受体α(estrogen receptora，ESRα)结合发挥作用[5-7]，而ESRα基因突变会导致雌激素功能的下降，引起HBV感染人群不同的遗传易感性[8]，贵州是一个多民族省份，少数民族人口众多，且大多聚居于较封闭偏远的山区，形成了遗传学上相对隔离的人群。选用这样相对封闭的隔离自然人群作为研究对象，可以最大限度的排除基因流(gene flow)现象对该人群等位基因频率、基因型频率的影响，对多基因疾病研究具有独特的优势。

1对象与方法

1.1　研究对象

按照知情同意原则，随机对贵州省荔波县少数民族进行问卷调查和抽样分析，根据乙肝血清标志物、肝功能指标及HBV病毒DNA定量结果分别选取健康对照91例，男性45例，女性46例，(47.8±1.57)岁；HBsAg携带者80例，男性41例，女性39例，(48.5±1.42)岁。所选的研究对象3代内无族外通婚史，彼此间无直接血缘关系 ，性别、年龄匹配 ，无乙型肝炎疫苗接种史。

1.2　全血DNA提取与定量

采用Qiagen公司的FlexiGene DNA提取试剂盒提取全血DNA；紫外吸收法测定DNA浓度，并标化DNA模板浓度为100 mg/L。

1.3　ESRα基因PvuⅡ和T29C多态性位点基因扩增

采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性 (PCR-RFLP)法，根据GenBank中ESRα基因PvuⅡ和T29C多态性位点的基因序列，设计PvuⅡ多态位点引物，上游系列为5′-TCTCCCACCTCAGCCTTAC-3′，下游系列为5′-ACCAATGCTC ATCCCAAC-3′，扩增产物长为448 bp。参照文献[9] 设计T29C多态位点引物，上游系列为5′- GACCATGACCCTCCACACCAAAGGA TC-3′，下游系列为5′-ACCGTAGACCTGCGCGTTG-3′，扩增产物长218 bp。引物由上海生物工程技术有限公司合成。反应采用Touch-down PCR法： 94 ℃变性40 s、62 ℃退火50 s(每个循环降低0.5 ℃)、72 ℃延伸40 s，扩增14个循环后改为94 ℃变性40 s、55 ℃退火50 s、72 ℃延伸40 s继续20个循环。PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4　PCR产物的酶切

ESRα基因PvuⅡ、T29C位点 PCR产物分别以限制性核酸内切酶PvuⅡ、MspⅠ酶切，37 ℃恒温水浴过夜，酶切产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定。

1.5　统计学方法

以Hardy-Weinberg平衡吻合度检验确定对照组遗传平衡状况，根据PCR-RFLP结果确定样本的基因型，用直接计数法计算基因型频率和等位基因频率；SPSS 19.0统计软件的χ2检验分析各基因型在2组人群中的分布。

2结果

2.1　ESRα 基因PvuⅡ和T29C位点

PCR-RFLP结果显示ESRα基因PvuⅡ位点的扩增产物长度为448 bp，每例样本的目的条带清晰，适于后续PCR产物的PvuⅡ酶切反应。若ESRα基因PvuⅡ位点未发生突变，为野生型CC，不产生酶切位点(仅见448 bp片段)；若由野生型C突变成T，为突变型TT片段中产生酶切位点，酶切后观察到380 bp、68 bp为突变型TT，观察到448 bp、380 bp、68 bp 3个片段为杂合型CT；因 68 bp片段较小不易观察，故不作为观察项(见图1)。ESRα基因T29C位点的扩增产物长度218 bp，每例样本的目的条带清晰，适于后续PCR产物的MspⅠ酶切反应。ESRα基因T29C位点若为野生型TT，无MspⅠ酶切位点(仅见218 bp)；若由野生型T突变成C，片段中产生MspⅠ酶切位点，酶切后可为突变型CC(观察到192 bp、26 bp 2个片段)、或杂合型TC(观察到218 bp、192 bp、26 bp 3个片段)；因 26 bp片段较小不易观察，故不作为观察项。见图1。

注：ESRα基因T29C位点结果为 1、2、3、4，1为PCR扩增产物，2-4为酶切产物，2为野生型TT，3为突变型CC，4为杂合型TC；ESRα基因 PvuⅡ位点结果为5、6、7、8，5为PCR扩增产物，6-8为酶切产物，6为野生型CC，7为突变型TT，8为杂合型CT图1　ESRα基因PvuⅡ和T29C位点PCR扩增产物和酶切产物电泳图Fig.1　Electrophoresis of PCR amplification products and enzyme digestion products of PvuⅡ and T29C loci of ESR gene

2.2　HBV感染与ESRα 基因PvuⅡ和T29C位点的基因型频率和等位基因频率

ESRα基因PvuⅡ和T29C位点基因型频率和等位基因频率在贵州少数民族健康对照组和HBsAg携带组中的分布差异无统计学意义(P>0.05)。见表1，表2。

表1　HBV感染与ESRα基因PvuⅡ多态性

表2　HBV感染与ESRα 基因T29C位点多态性

3讨论

雌激素受体是存在于靶器官的细胞内、可与激素发生特异性结合而形成激素-受体复合物、是使激素发挥其生物学效应的一种蛋白质分子，至今发现的ESR有ESRα和ESRβ两种亚型。人体中ESRα基因定位于第6号染色体短臂的第2区5号带中的第1亚带，由140 kb碱基构成，编码595个氨基酸的蛋白质，包括8个外显子和7个内含子[10]。ESR不同的基因型有可能决定不同个体间 ESR的表达水平与功能差异，从而影响到病原体对宿主的易感性。1993年，骆抗先等[11]对中国7个民族的HBV感染调查发现HBsAg具有较高的阳性率，且这些民族间HBV感染存在差异。2006年，谢建萍等[12]研究发现，ESRα基因PvuⅡ位点多态性与HBV感染后疾病进展密切相关；2009年，郜玉峰等[13]的研究显示ESRα基因PvuⅡ位点C/T基因型和C等位基因可能是乙型肝炎病毒感染慢性化的遗传易感基因。也有大样本研究发现，ESRα基因T29C位点基因多态性与HBV持续性感染相关[13]；对甘肃地区人群的ESRα基因T29C位点基因多态性与HBV感染转归的研究结果也显示，ESRα基因T29C位点TT 基因型和T等位基因可能是HBV感染慢性化的遗传易感基因[14]。但本次研究结果却显示ESRα基因PvuⅡ和T29C位点基因多态性的分布在贵州荔波少数民族HBV感染组和健康对照组中差异无统计学意义，这与单可人等[15]对贵州彝族ESRα基因T29C基因型分布与 HBV 感染研究结果一致，提示不同民族和城乡区域中ESRα基因PvuⅡ和T29C位点的分布存在差异，ESR基因PvuⅡ和T29C位点基因多态性在HBV感染的发生发展中起主要作用还是辅助作用，或是协同作用，又或是ESR基因多态性是否真正与HBV感染密切相关，尚有待于进一步大样本的研究证实。

参考文献4

[1] Hvanchy D． Hepatitis B virus epidemiology, disease burden, treatment, and current and emerging prevention and eantrol measures [J]. J Viral Hepat, 2004(2): 97-107.

[2] 巫责成, 周卫平, 赵有蓉, 等. 慢性乙型肝炎患者远期生存质量研究[J]．中华肝脏病杂志, 2003(5): 275-277.

[3] 苏勤. 乙型肝炎病毒慢性感染和肝癌发生[J]. 世界华人消化杂志, 2003(6):791-795.

[4] Thursz M. Genetic susceptibility in chronic viral hepatitis[J]．Antiviral Res, 2001(2):113-116.

[5] Wasmuth HE, Lammert F, Matern S. Genetic risk factors for hepatic Fibrosis in chronic liver diseases[J]. Med Klin(Munich), 2003(12):754-762.

[6] Giannitrapani L, Soresi M, La Spada E, et al．Sex hormones and risk of liver tumor [J]. Ann N Y Acad Sci, 2006(1089):228-236.

[7] Villa E, Grottola A, Colantoni A, et al. Hepatocellular carcinoma: role of estrogen receptors in the liver[J]．Ann N Y Aead Sci, 2002(963):37-45.

[8] Villa E, Dugani A, Moles A, et al. Variant liver estrogen receptor transcripts already occur at an early stage of chronic liver disease[J]. Hepatology, 1998(4):983-988.

[9] Deng G, Zhou G, Zhai Y, et al. Association of estrogen receptor alpha polymorphisms with susceptibility to chronic hepatitis B virus infection[J]．Hepatology, 2004(2):318-326.

[10]李定国, 刘清华．雌激素与肝纤维化研究现状[J]．国外医学-消化系疾病分册, 2005(4)：195-197.

[11]骆抗先, 何超, 何海棠, 等. 汉藏傣瑶维蒙黎族人群乙型肝炎病毒感染调查 [J]. 中华流行病学杂志, 1993(5):266-270.

[12]谢建萍, 龚先琼, 谭德明, 等．雌激素受体基因多态性与乙型肝炎肝硬化的相关性研究叨[J]. 中南大学学报:医学版, 2006(3):379-382.

[13]郜玉峰, 魏少峰, 张亚飞, 等. 雌激素受体基因α多态性与乙型肝炎病毒感染慢性化的相关性研究[J].实用肝脏病杂志, 2009(2):95-97.

[14]周宁, 李象霖, 张月萍, 等. 甘肃地区人群雌激素受体α-29位基因多态性与HBV感染转归的关系[J].临床肝胆病杂志, 2014 (2):128-131.

[15]单可人, 王婵娟, 龙丽, 等. 贵州彝族乙型肝炎病毒感染与IL-10 592位点及 ESR1 T29C 位点多态性相关性研究[J]. 中国实用内科杂志, 2010(4):334-336.

(2015-01-09收稿，2015-02-25修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 周凌

Study on Association ofESRαPvuⅡ and T29C Gene Polymorphism

with Susceptibility to Hepatitis B Virus Infection in Libo

Minority Population of Guizhou Province

ZUO Ya, HE Yan, ZHAO Xiaomei, ZHANG Ting,WANG Chanjuan, YU Wenfeng， GUAN Zhizhong

(TheKeyLaboratoryofMolecularBiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: Analysis on the correlation of the polymorphism of estrogen receptor (ESRα) gene PvuⅡ and T29C loci with hepatitis B virus (HBV) infection in Libo minority population of Guizhou province. Methods: Polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) technique was used to analyze the polymorphism of PvuⅡ and T29C loci in 91 healthy controls and 80 HBsAg carriers, the correlation of these two loci with susceptibility to HBV was analyzed. Results: Three genotypes of ESRα PvuⅡand T29C loci were detected in both control group and HBsAg group. Between two groups, the three kinds of gene frequency and allele frequency distribution showed no statistical difference (P>0.05). Conclusions: The PvuⅡ and T29C loci gene polymorphism of ESR is not associated with HBV susceptibility in Libo minority nationality.

[Key words]ethnic minorities； gene; estrogen receptor； hepatitis B; carries; infection； polymorphism; Guizhou,Libo

[中图分类号]R394； R34-33； RZ273

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2015)03-0222-03

通信作者***E-mail:annieheyan@gmc.edu.cn

[基金项目]**贵阳医学院2010级生物技术专业本科生