hFAM92A1在人宫颈癌细胞不同周期时相的表达*



hFAM92A1在人宫颈癌细胞不同周期时相的表达*

网络出版时间：2015-03-19网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.0926.001.html

方娟1, 王珺1, 龚坚1, 王燕1, 阮绪芝2**

(1.湖北医药学院 基础医学研究所， 湖北 十堰442000； 2.湖北医药学院 科技处， 湖北 十堰442000)

[摘要]目的： 探讨hFAM92A1在人宫颈癌HeLa细胞不同周期时相的表达差异。方法： 常规培养Hela细胞，应用血清饥饿法将HeLa细胞同步化于G1期，胸腺嘧啶核苷双阻断法同步化于S、G2期，秋水仙素阻断法同步化于M期，应用流式细胞术检测同步化效率，应用RT-PCR方法检测hFAM92A1在人宫颈癌HeLa细胞不同周期时相的表达水平。结果： 流式细胞仪检测细胞同步化效率G1期为77.5%、S期为85.5%、G2期为61.9%、M期为44%；FAM92A1基因在各期均有表达，但存在差异，以S期表达最高。结论： FAM92A1基因在HeLa细胞不同周期时相的表达有较大差异。

[关键词]基因； 子宫颈； 癌； 细胞周期

细胞周期是指连续分裂的细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂的整个连续的过程。细胞周期的运行受多个因素的影响，有2个调控点，一个是G1/S期转折点，另一个是G2/M期转折点，细胞周期失控运行将导致癌的发生。因此，增殖相关基因在肿瘤细胞周期调控中的作用研究是认识肿瘤发生机制的重要内容。FAM92A1基因是在前期研究中发现的一个位于细胞核的基因[1-2]，在人多种正常组织和癌组织中广泛表达，可能参与细胞周期调控。细胞周期调节异常是癌症研究领域的一个热点[4-8]。已有文献报道宫颈癌有细胞周期失控现象存在。本实验通过研究hFAM92A1在人宫颈癌HeLa细胞不同周期时相的表达差异，为研究hFAM92A1基因的生物学功能奠定基础。

1材料与方法

1.1　材料和仪器

人宫颈癌HeLa细胞株由本室保存，DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司，胸腺嘧啶核苷、秋水仙素购自Sigma公司, Trizol购自Invitrogin, RT-PCR引物由上海生工合成，逆转录试剂盒购自Promega，细胞周期检测试剂盒购自凯基生物科技发展有限公司。所需仪器有CO2培养箱、低温冷冻离心机(Eppendorf)、倒置显微镜(莱卡)、PCR仪(Eppendorf)、荧光定量PCR仪(ABI)，流式细胞仪(FAC Scalibur)，紫外分光光度仪(UV-3802)。

1.2　HeLa细胞培养及同步化

用含10%胎牛血清的DMEM培养基， 5% CO2培养箱中培养，细胞密度90%时，接种到6孔板中，取对数生长期细胞用于实验。G1期细胞同步化采用血清饥饿的方法，当细胞密度达80%时，换成无血清培养基培养42 h后收集G1期细胞。S期细胞同步化采用胸腺嘧啶核苷双阻断法，细胞密度达80%时,加入含终浓度为2 mmol/L胸腺嘧啶核苷的培养基培养16 h，弃去培养基，PBS洗2遍，换成含10%胎牛血清的DMEM培养基，5% CO2培养箱中培养9 h，再加入含终浓度为2 mmol/L胸腺嘧啶核苷的培养基培养16 h，弃去培养基，PBS洗2遍，换成10%胎牛血清的DMEM培养基，5% CO2培养箱中培养6 h收集S期细胞；G2细胞同步化采用胸腺嘧啶核苷双阻断法，在第二次阻断释放后培养9 h收集G2期细胞。M期细胞同步化采用秋水仙素阻断法，细胞融合率达80%时，换成秋水仙素终浓度为1 mg/L的培养基,5% CO2培养箱中培养7 h后收集M期细胞。

1.3　细胞周期同步化效率检测

收集到的各期细胞加75%的冰乙醇5 mL 4 ℃固定过夜，1 000 r/min离心5 min弃上清，加PBS洗涤,1 000 r/min离心5 min，弃上清，加100 μL RNaseA 37 ℃水浴30 min，加400 μL碘化丙定(PI)染色混匀，4 ℃避光30 min，用流式细胞仪检测同步化效率。

1.4　细胞总RNA的提取

收集到的各期细胞分别加500 μL Trizol液充分裂解细胞，收集到无RNA酶的EP管中，加入100 μL氯仿，室温静置3 min，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min,吸取上清，加入等体积的异丙醇，剧烈震荡15 s，室温静置10 min，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，弃上清，加入预冷75%乙醇800 μL，4 ℃ 7 500 r/min离心5 min，弃上清，干燥5 min，加入无RNA酶水20 μL，取1 μL RNA，按照1∶50的比例稀释后用紫外分光光度仪检测A260和A280的值，对总的RNA浓度进行定量分析，余下的放-80 ℃保存。

1.5　RT-PCR

收集同步化的各个周期时相的细胞，以不做任何处理HeLa细胞为对照，以GAPDH为内参，检测HeLa细胞中FAM92A1的表达。按照Promega逆转录试剂盒说明书操作，取1 000 ngRNA为模板，总体积为20 μL，逆转录条件，70 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min，-20 ℃保存；RT-PCR，将上述逆转录产物稀释10倍后取2 μL为模板，反应总体积为25 μL，反应条件为95 ℃ 2 min预变性，95 ℃ 15 s，55 ℃ 22 s，72 ℃ 20 s，72 ℃ 5 min，36循环，用琼脂糖凝胶方法分析。

2结果

2.1　总RNA纯度

外分光光度仪检测吸光度结果，G1期A260值为0.245,A260/A280比值为 1.91;S 期A260值为0.320,A260/A280比值为2.01;G2 期A260值为0.224,A260/A280比值为1.95;M期A260值为0.106,A260/A280比值为1.96。电泳结果清晰显示5 S、18 S、28 S三个条带，且18 S和28 S的灰度比为1∶2，表明所提RNA纯度很高，能够满足下一步实验要求。见图1。

注：DL2000为标准分子量参照物大小为2 000 bp、1 000 bp、750 bp、500 bp、250 bp，Hela细胞1-5分别为正常，G1、S、G2、M各时相图1　Hela细胞总RNA电泳图Fig.1　Electrophoresis of total RNA of HeLa cells in each phase

2.2　HeLa细胞同步化效率检测

HeLa细胞各期同步化后，经流式细胞仪检测，G1期同步化效率为 77.5%，S期同步化效率为 85.5%，G2期同步化效率 61.9%，M 期同步化效率为44%。

2.3　FAM92A1表达

RT-PCR结果显示FAM92A1的表达随细胞周期时相的变化而存在差异，以S期表达量最高(如图2)。

1~5为对照、M期、G2期、S期及G1期HeLa细胞中FAM92A1的表达， 6~10为对照、M期、G2期、S期及G1期HeLa细胞中GAPDH内参的表达图2　HeLa细胞不同周期时相FAM92A1基因的表达Fig.2　FAM92A1 gene expression of HeLa cells in different phases

3讨论

FAM92A1基因是近期发现的一个新基因，与细胞增殖关系密切，在正常生长旺盛的组织和肿瘤组织中高度表达，参与细胞周期调控[10]，但是其生物学功能目前尚不明确。

细胞正常的分裂、增殖、分化与衰老维持着机体的稳定，细胞周期的异常会导致这一过程的紊乱。许多生长因子、细胞因子、激素及癌基因产物对DNA代谢的调节都是通过影响细胞周期实现的，许多基因的表达又受到细胞周期的制约。调控细胞周期的核心因子就是细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK，cyclin dependent kinase)，它与不同的细胞周期蛋白形成多种复合物，作用于细胞周期的不同时相，决定着细胞周期的进程。而近几年来陆续发现的多种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(CKI，cyclin dependent kinase inhibitor)，更加深了对肿瘤发生机制的了解。

基因突变或基因表达异常是肿瘤发生的关键。为了深入研究FAM92A1基因的生物学功能，本研究从细胞周期入手，首先通过细胞同步化方法，将细胞同步化于G1,S,G2,M期，运用流式细胞仪检测同步化效率，接着运用RT-PCR证实FAM92A1在HeLa细胞各个时相均有表达，以S期表达量最高，G1,G2,M期表达较低，这种各时相表达的差异性可能与FAM92A1在细胞周期中所起的调控作用关系密切。又知S期细胞的主要活动是进行DNA复制，DNA复制完成与否直接影响细胞增殖周期的运行，hFAM92A1基因过表达时发生S期阻滞，提示其与DNA复制有关。那么FAM92A1基因在其它肿瘤细胞各时相的表达及其具体的生物学功能又是怎么样的？有待于进一步的研究。

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(2014-12-06收稿，2015-02-21修回)

中文编辑： 周凌； 英文编辑： 赵毅

Expression of hFAM92A1 in Different Cell Cycle Time Phases

of Human Cervical Carcinoma HeLa Cells

FANG Juan1, WANG Jun1, GONG Jian1, WANG Yan1, RUAN Xuzhi2

(InstituteofBasicMedicine,HubeiMedicalCollege,Shiyan442000,Hubei,China; 2.DivisionofScienceand

Technology,HubeiMedicalCollege,Shiyan442000,Hubei,China)

[Abstract]Objective: To investigate the expression differences of hFAM92A1 in different cell cycle time phases of HeLa cells of human cervical carcinoma. Methods: HeLa cells were conventionally cultured and synchronized in G1 phase using serum starvation, synchronized in G2 and S phase using double thymidine blocking, synchronized in M phase using colchicine blocking, and synchronizing efficiency was tested by flow cytometry. RT-PCR method was adopted to detect the expression of hFAM92A1 in different cell cycle phases of HeLa cells. Results: Flow cytometry instrument detected cell synchronization efficiency as follows： G1 phase 77.5%, S phase 85.5%,G2 phase 61.9%，M phase 44%. FAM92A1 genes were expressed in each period but with differences, the highest expression was in S phase. Conclusions: FAM92A1 gene of HeLa cell expression in different cycle phases exhibit notable differences.

[Key words]genes; cervix uteri; carcinoma; cell cycle

[中图分类号]R737.33

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2015)03-0304-03

通信作者**E-mail:ranxuzhi@163.com

[基金项目]*湖北医药学院硕士启动金项目(No：2012ZRQDJ09)