基于正交设计的不同针刺因素对皮质酮肾阳虚大鼠垂体-性腺轴的影响*

*基金项目: 国家自然科学基金项目(81360562)；江西省卫计委中医药科研计划重点项目(2014Z006) 。

**第一作者： 裴佳 (1990— )，女，2013级在读研究生。

基于正交设计的不同针刺因素对皮质酮肾阳虚大鼠垂体-性腺轴的影响*

*基金项目: 国家自然科学基金项目(81360562)；江西省卫计委中医药科研计划重点项目(2014Z006) 。

**第一作者： 裴佳 (1990— )，女，2013级在读研究生。

★裴佳1**程立红2闵友江2***闵志云1丁李立强1张辉1(1.江西中医药大学南昌 330004；2.江西中医药大学附属医院南昌 330006)

摘要：目的：探索影响针刺效应的主次因素和针刺参数的最佳组合，以期为提高针刺疗效、指导针灸临床提供理论依据。方法：采用L9(34)正交表对影响针刺效应的4因素(穴位的选择、捻针角度、捻针频率、捻针时间)3水平安排试验，运用计算机控制针刺手法仪治疗肾阳虚大鼠，通过酶联免疫检测血清T、E2和实时荧光定量PCR检测垂体中LH、FSH mRNA表达的水平来比较上述4因素的主次。结果：上述4因素对针刺效应的影响大小依次是穴位选择、捻针角度、捻针频率、捻针时间，其中腧穴的选择是影响针刺效应的重要因素(P<0.05)；捻针角度、捻针频率和捻针时间是影响针刺效应的次要因素(P>0.05)。结论：针刺治疗肾阳虚大鼠的最佳针刺参数为针刺肾俞穴，捻针角度为90°，频率为60次/min，捻针60s；不同因素对针刺治疗肾阳虚大鼠的疗效不同，其中穴位的选择对疗效的影响最大，其次为捻针角度，再次是捻针频率，最次是捻针时间。

关键词：正交设计；针刺因素；肾阳虚

针灸是通过疏通经络、调和阴阳、扶正祛邪作用治疗疾病的。其扶正祛邪的作用是通过针灸能产生补虚泻实的效应来实现的。一般认为针灸补虚泻实的效应与穴位的相对特异性、补泻手法、机体的机能状态、刺激量的大小等因素有关[1-4]。而刺激量的大小又与作用时间(行针时间、留针时间、针刺间隔时间、针刺次数或疗程)和针刺强度(提插的幅度、捻转的角度、提插捻转的频率、针具的粗细、针刺深浅)有关[3]。但对于针刺补泻效应与穴位的相对特异性、刺激量的关系如何？针刺刺激量能不能做到定量？影响针刺效应的主次因素是什么？能否获取最佳针刺效应多因素的最佳组合？对于这些问题，有些学者[5-7]做过一些理论上的探讨或实验研究，但存在一些不足之处。为进一步客观、科学、定量地研究针刺效应与不同针刺因素的关系，本研究在皮质酮肾阳虚大鼠模型的基础上采用L9(34)正交表对影响针刺效应的4因素(穴位的选择、捻针角度、捻针频率、捻针时间)3水平安排试验，通过采用计算机控制针刺手法仪对肾阳虚大鼠进行针刺效应影响因素定性定量化实验研究，现将研究阐述如下。

1实验材料

1.1实验动物60只SD大鼠，雄性，体重220g左右,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，合格证号(SCXK 2011-0003)，清洁级，饲料喂养。所有大鼠进行饲养3d后开始进行实验；根据《实验针灸学》[8]进行定穴，剪去穴位处的毛发。

1.2实验器材0.5寸30号华佗牌一次性针灸针(苏州医疗器械厂生产)；酶标仪(Labsystems Multiskan MS公司生产)；洗板机(Thermo Labsystems公司生产)；移液器(Pipetman生产)；计算机控制针刺手法仪(专利公开号:CN1709215)，上海中医药大学研制；旋涡振荡器(上海青浦泸西仪器厂生产)；手握式电动匀浆机(德国FLUKO 公司生产)；低温冷冻离心机(Sigma公司生产)；Real-time检测仪：(ABI公司生产)；超纯水分离系统(美国LABCONCO公司生产)。

1.3实验试剂氢化可的松注射液(天津金耀氨基酸有限公司生产，5ml/25mg，H12020886)；T、E2酶联免疫检测试剂盒(上海博谷生物科技有限公司生产)；Trizol(invitrogen公司生产)；DEPC处理水(基尔顿生物科技(上海)有限公司生产)；氯仿、异丙醇、无水乙醇(国药集团有限公司生产)；SYBR Green PCR试剂盒、逆转录试剂盒(Thermo公司生产)；RNaseⅠ(Fermentas公司生产)。

1.4药物对照组大鼠用药及用药剂量

1.4.1右归丸配方(按《景岳全书》记载)：肉桂、制附子各6g，山茱萸、当归各9g，山药、枸杞子、鹿角胶、杜仲、菟丝子各12g，熟地黄24g。全部药材从江西中医药大学附属医院中药房购进。煎煮方法参考相关文献[9]。

1.4.2用药剂量：按70kg体重成年人每日1剂药，每剂400mL煎剂计算，200g大鼠的右归丸煎剂灌服用量换算公式[10]：大鼠日服总量=人日服总量(400mL)×大鼠与人体表面积比(0.018) =7.2mL。分两次灌服。

2方法

2.1实验干预因素设计①因素A-针刺穴位选择：根据前期工作基础，选择肾俞穴治疗肾阳虚证大鼠；选择前三里作为对照穴位之一；非穴区，拟选择前三里旁开5mm处的点，作为对照穴位之一。②因素B-捻针角度：综合文献和项目组成人员的临床经验，拟将捻针角度设定为360°、180°和90°三个水平。③因素C-捻针频率：综合文献和项目组成人员的临床经验，拟将捻针频率设定为180次/min、120次/min和60次/min三个水平。④因素D-捻针时间：综合文献和和前期研究，拟将每次捻针的时间设定为120s、60s和30s三个水平。见表1。

影响针刺效应的因素有针刺穴位选择、捻针角度、捻针频率、捻针时间，本实验在肾阳虚大鼠模型的基础对上述4因素3水平采用正交表安排试验。查统计表，选择L9(34 )正交设计表安排实验。

2.2分组和造模60只SD雄性大鼠饲养3天后按体重查随机表随机分成2组，一组为8只，作为正常对照组；另一组为52只，用于实验造模。造模方法：每只大鼠以0.03mg/g剂量肌注射氢化可的松，每日1次，连续肌注10d。52只造模后的肾阳虚大鼠，按体重查随机表随机分成11组，一组8只，作为模型对照组，另一组8只作为右归丸治疗对照组，其它9组作为实验组，每组4只。

2.3治疗方法

表1　实验干预因素具体设计方案

2.3.1采用自制的固定器捆绑大鼠，0.5寸30号的毫针刺入穴位5mm～7mm，进针后稍稍提插捻转，然后与针刺手法仪连接，按相应参数进行针刺手法操作，留针10min，再手法操作1次，再留针10min，然后出针。设正常对照组，采用氢化可的松造模为模型组，按右归丸配方煎药灌胃作为药物对照组，各组共治疗14d。对照组大鼠进行相同的捆绑。治疗结束后处死动物提取相应的组织进行相关指标的检测。

2.4指标检测及方法

2.4.1治疗方法标本采集 治疗结束第2d处死大鼠。抽取动脉血，离心，取上清液，分装，-20℃的冰箱中保存备用。断头，用咬骨钳咬掉颅骨，分离垂体，立即投入到液氮中速冻，然后放入-80℃的冰箱中保存备用。

2.4.2血清T、E2的检测 采用酶联免疫方法测量其浓度，按照试剂盒说明书进行操作。

2.4.3 垂体LH、FSH mRNA表达的检测和实时荧光定量PCR

2.4.3.1 组织总RNA的抽提按Trizol说明书操作。

2.4.3.2 反转录cDNA 反应体系为RNA-Primer Mix：12μL；5×RT Reaction Buffer：5μL；25mM dNTPs：1μL；25U/μL RNase Inhibitor：1μL；200U/μL M-MLV Rtase：1μL；Oligo(dt)18：1μL；ddH2O(DNase-free)：4μL。总体积：25μL。扩增条件为37℃，60min；85℃，5min；4℃，5min；置于-20℃保存。

2.4.3.3Real-time PCR扩增 扩增体系为SYBRGreen Mix：12.5μL；上游引物F：0.5μL；下游引物R：0.5μL；ddH2O：9.5μL；cDNA模板：2μL。总体积：25μL。扩增条件为95℃，10min(95℃，15S；60℃，45Sec)×40；95℃,15 S； 60℃，1min；95℃,15 S；60℃, 15 S。引物的合成与纯化均由上海捷瑞生物科技有限公司提供。LH上游引物序列为5'- GCTCGGAGGATGGCTCTTTT-3'，下游引物序列为5'- AGCACAGATGACGACGAAGG-3'； FSH上游引物序列为5'- TAAGGATGGCCTTGCTCCTG-3'，下游引物序列为5'- GCTTGGTGAGCACAAACCTC-3'。

2.4.3.4相对mRNA表达水平的计算数据分析采用ABI Prism 7300 SDS Software。每个样品中靶基因的相对mRNA表达水平采用以下公式计算：相对mRNA表达=2-△Ct×100% ，其中△Ct =靶基因Ct值-管家基因Ct值。

3结果

造模的大鼠体重减轻，毛发失去光泽，弓背，扎堆，反应迟钝，活动减少，阴囊皱缩，尿量明显增多；经针刺和右归丸治疗后，大鼠食欲增加，体重加重，毛发渐渐有光泽，喜欢活动，而模型对照组的大鼠整体情况不佳。

四个指标在正常对照组与模型对照组之间比较，均具有极显著性差异(P<0.01)；LH mRNA在药物对照组与模型对照组之间比较，具有极显著性差(P<0.05)，其它三个指标在药物对照组与模型对照组之间比较，均具有极显著性差异(P<0.01)。说明采用右归丸治疗氢化可的松造模形成的肾阳虚是有效的；通过大鼠一般情况的比较及以方测证的结果，说明采用氢化可的松造模方法是成功的。结果见表2。

表2　模型组分别与正常对照组和药物对照组比较

注：与模型组比较，①P<0.01，②P<0.05；与药物观察组比较，③P<0.01，④P<0.05。由于LH、FSH mRNA检测的数值较小，本文中LH、FSH mRNA 所有数值是×1000后的结果。

经直观分析，R值越大，针刺治疗效果越好。对血清T水平的影响从大到小排列顺序为：穴位选择、捻针角度、捻针时间、捻针频率，最佳组合是A3B3C3D2；对血清E2水平的影响从大到小排列顺序为：穴位选择、捻针时间、捻针频率、捻针角度，最佳组合是A3B2C1D1；对垂体组织LH mRNA表达的影响从大到小排列顺序为：捻针频率、捻针角度、捻针时间、穴位选择，最佳组合是A2B3C2D2；对垂体组织FSH mRNA表达的影响从大到小排列顺序为：捻针时间、捻针角度、捻针频率、穴位选择，最佳组合是A3B1C3D2，见表3。结合表4各因素对以血清T、E2水平和垂体LH、FSH mRNA表达影响的方差分析结果，即不同针刺因素影响针刺效应主次的权重和每一针刺因素不同水平优劣的权重，对针刺效应的影响从大到小排列顺序为：穴位选择、捻针角度、捻针频率、捻针时间，最佳组合是A3B3C3D2，即针刺肾俞穴，捻针角度为90°，频率为60次/min，捻针60s。

表3　4因素3水平的正交实验设计方案及相关指标极差分析

综合分析结果，腧穴的选择对血清E2水平、垂体FSH mRNA表达的影响是重要因素(P<0.05)，对血清T水平的影响是主要因素(P<0.01)，对垂体LH mRNA表达的影响是次要因素(P>0.05)；针刺捻针角度对血清T、E2水平及垂体LH mRAN表达的影响都是次要因素(P>0.05)，对垂体FSH mRAN表达的影响是主要因素(P<0.01)；捻针频率对血清T、E2含量及垂体FSH mRNA表达的影响都属于次要因素(P>0.05)，对垂体LH mRAN表达的影响是重要因素(P<0.05)；捻针时间对上述四个指标的影响是次要因素(P>0.05)。根据不同因素主次的权重和每一因素不同水平优劣的权重综合分析，腧穴的选择是影响针刺效应的重要因素，而捻针角度、捻针频率和捻针时间都是影响针刺效应的次要因素，见表4。

4讨论

临床长期大量使用肾上腺皮质激素治疗的病人停药后表现为肾上腺皮质功能低下出现肾阳虚一系列症状。沈自尹院士[11]几十年来的研究证实肾阳虚证的物质基础在于下丘脑-垂体-靶腺(肾上腺、甲状腺、性腺)轴的功能低下。马娜等[12]采用氢化可的松制作肾阳虚证动物模型，在肌注氢化可的松的同时于第8d开始用右归丸治疗，分别于第15、23、30d后采用放免法检测大鼠血清中FSH、LH、T的含量，发现模型组大鼠各期FSH、LH、T 水平均明显下降，右归丸治疗能使低下的FSH、LH、T水平升高，但不同时期的作用有差异。刘天成等[13]用同样的方法制作皮质酮肾阳虚实验动物模型，研究发现模型组大鼠血清T含量明显降低，而右归丸治疗能显著提高肾阳虚大鼠血清T含量。杨廉等[14]研究发现温针灸肾俞穴具有明显调节性激素的作用。本实验模型组大鼠血清T、E2和垂体LH、FSH mRNA的表达分别明显低于正常对照组，右归丸治疗后上述指标都有不同程度的升高。另外不同针刺观察组指标的均值大部分介于模型组与正常组之间，针刺治疗肾阳虚证的作用机制可能是针刺能够使功能低下的垂体-性腺轴功能趋于正常。

肾阳虚证模型是中医虚证实验研究中运用得最多且比较成功的动物模型之一。该动物模型是依据临床肾阳虚患者肾上腺皮质功能低下而设计的。基于前期研究[9]及按照陈英华等[15]提出的评价肾阳虚动物模型从一般状态与实验检测、客观指标、药物反证几个方面进行评价的科学设想，本实验采用氢化可的松肌肉注射制作肾阳虚证实验动物模型；通过对大鼠进行一般情况观察、右归丸治疗反证、模型组血清T、E2和垂体LH、FSH mRNA的表达分别明显低于正常对照组和右归丸观察组，表明模型是成功的。

本实验分别以血清T、E2和垂体LH、FSH mRNA的表达为观察对象进行方差分析结果表明，腧穴的选择是影响针刺效应的主要因素。对于肾阳虚证来说，选择肾俞穴的治疗效果要好于前三里，好于非穴区。黄成等[16]研究发现艾灸或针剌老年大鼠“肾俞”，能增加其垂体及血清LH、FSH水平，因此认为针灸可使老年大鼠低下的垂体内分泌水平得到恢复。而前三里是手阳明大肠经的腧穴，与肾没有直接的关系；从现代医学分析，前三里与肾阳虚证的靶腺(肾上腺、甲状腺、性腺)也没有直接的联系。

表4　以血清T、E2水平和垂体LH、FSH mRNA的表达为观察指标的针刺多因素方差分析

而所选择的非穴区更无上述相关联系。因此，通过上述的分析与本实验研究的结果，腧穴主治作用还是有相对特异性的。

本实验分别以血清T、E2和垂体LH、FSH mRNA的表达为观察对象进行方差分析结果表明，针刺捻针角度、捻针频率和捻针时间是影响针刺效应的次要因素。捻针角度、频率和时间是构成针刺刺激量的主要要素，但针具的粗细也是构成针刺刺激量的主要要素之一。至于针刺捻针角度、频率、时间在本实验中处于次要因素的可能原因是针灸针对大鼠的刺激量太大，当再进行捻针时，其捻针的角度、频率、时间所形成的针刺刺激量的累积，大鼠可能已经不能感受。

本实验使用的计算机控制针刺手法仪只对针刺捻针的角度、频率、时间进行定量控制，本实验采用的计算机控制针刺手法仪还不能模拟针刺补泻手法，针刺补泻手法很可能与针刺取穴、捻针角度、频率、时间存在交互作用，由于硬件和软件等各方面的原因，补泻手法没有作为独立因素进行研究。

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Empirical Study on the Influences of Different Acupuncture Factors on Pituitary-gonad Axis in Hydrocortisone Rats with Kidney-YANG Deficiency Based on Orthogonal Design

PEI Jia1, CHENG Li-hong2, MIN You-jiang2, MIN Zhi-yun1, DING Li- li-qiang1, ZHANG Hui1

1.JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China;

2.AffiliatedHospitalofJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330006,China.

Abstract:Objective: To explore primary & secondary factors that influence acupuncture effectiveness and the best combination of acupuncture parameters, in order to provide experimental evidence to elevate acupuncture effectiveness for clinic application. Orthogonal design was adopted to study several factors that influence acupuncture effectiveness. The rats model of kidney-YANG deficiency made by hydrocortisone as the study objects. Methods: 4 influential factors (i.e. selection of acupoints, twisting-rotating angle, twisting-rotating frequency and acupuncture time) plus 3 levels of each factor were arranged to L9(34) orthogonal table. Treat kidney-YANG deficiency rats by computer controlled acupuncture manipulation device. Serum T and E2 were evaluated by ELISA method and pituitary LH and FSH mRNA expression by real time fluorescent quantitation PCR to illustrate the primary & secondary factors and the good & bad of different levels in each factor that could affect the acupuncture effectiveness. Results: Among 4 factors mentioned above, the order for influential factors from major to small is acupoints selection, twisting-rotating angle, twisting-rotating frequency and acupuncure time, among which, selection of acupoints was the major factors (P<0.05), twisting-rotating angle, twisting-rotating frequency and acupuncture time were the secondary factors (P>0.05,P>0.05 and P>0.05) .Conclusion : ①The best acupuncture parameters for treating kidney-YANG deficiency rats were: selecting Shenshu acupoint (B23), 90°of twisting-rotating angle, 60tpm of twisting-rotating frequency and 60s of acupuncture time;②In this study, different acupuncture parameter has different efficacy for kidney-YANG deficiency rats; among them, selection of acupoints became the biggest influential factor, the next was twisting-rotating angle, the secondary was twisting-rotating frequency, and the last one was acupuncture time.

Key words:Orthogonal design; Kidney-YANG deficiency; T;E2；LH; FSH

收稿日期：(2015-01-20)编辑：翟兴英

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

通信作者：***闵友江，男，博士，副教授，副主任医师。研究方向：运动系统疾病针灸治疗。Tel：13177788362；E-mail：myj2002@126.com。