芪参益气滴丸预适应内皮细胞对心肌细胞缺氧损伤的延迟保护作用*

马 妍 ，郭利平

1天津中医药大学，天津300193；2天津中医药大学保康医院

近年来研究发现反复短暂的心肌缺血可以使心肌对随后长时间的缺血再灌注损伤产生明显的耐受力，即缺血预适应现象(IPC)。IPC的保护作用包括预适应后立即产生持续1～3小时的早期保护作用与预适应后24小时出现持续3～4天的延迟保护作用。研究发现许多中药对心肌缺血再灌注损伤具有与IPC同等的保护作用［1］。IPC与中药预适应的作用不仅在动物体内得到证实，在离体实验研究中，通过应用缺氧预适应细胞模型［2］与缺氧复氧细胞模型分别模拟IPC与缺血再灌注损伤，证实经过缺血预适应或中药预适应的心肌细胞可对抗缺氧复氧损伤，内皮细胞亦具有相同作用。但是由心肌细胞与内皮细胞共同组成的心脏内环境中，是如何相互作用，中药预适应在其中会产生怎样的影响，有待进一步研究。芪参益气滴丸具有益气通脉、活血止痛之功效，在冠心病防治方面发挥着重要作用，国家“十五”科技攻关计划项目“芪参益气滴丸对心肌梗死二级预防的临床试验研究”的初步结果表明。芪参益气滴丸在心肌梗死的二级预防中显示出良好的效果［3］。本研究利用transwel l小室建立CMEC与CMC共培养体系，模拟心脏内环境，并且利用芪参益气滴丸对内皮细胞进行预适应，观察其对心肌细胞的延迟保护作用，并探讨CMEC与CMC的相互作用。

1 材料与方法

1.1 材料 Wistar乳鼠(3d内)，雌雄不拘［中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心提供，动物合格证号：SCXK-(军)2009-003］；胰蛋白酶(Sigma)；Ⅱ型胶原酶(Sigma)；DMEM-F12(Hyclone)；胎牛血清(Bioind)；5-溴脱氧尿嘧啶(Sigma)；0.25%胰酶(Hyclone)；双抗(青、链霉素)；PBS缓冲液(PH7.2～7.4)；芪参益气滴丸溶液(由天津天士力集团提供中药浸膏，按一定比例于完全培养基中混合溶解而成）；Transwel l小室(24 wel l，膜孔径 0.4μm，康宁 3470)；细胞增殖/毒性检测(CCK-8)试剂盒(同仁化学研究所，日本)；乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(北京中生生物工程高技术公司)；丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；超氧化物酶歧化酶(SOD)WST-1法测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；恒温二氧化碳培养箱(Thermo)；厌氧培养箱(Thermo)；倒置相差光学显微镜(Leica)；新颖立式小容量恒温摇床 (上海世平实验设备有限公司)；高速冷冻离心机(Beckman)；全自动生化分析仪(日立 7020型，日本)；多功能读板机(Tecan，瑞士)。

1.2 原代培养 无菌环境下，取乳鼠于75%酒精中浸泡5～6 s后置于培养皿中，开胸暴露心脏，于心脏收缩期剪下心脏放于预冷的PBS缓冲液中(含1%双抗)，留取心尖，将心尖组织移至锥形瓶瓶口剪碎，加入混合酶5mL(0.1%胶原酶与0.06%胰蛋白酶)于恒温摇床37℃，转速110 r/min震荡5分钟，第一次消化后弃上清，之后每次消化后需收集上清液，经200目细胞筛过滤至预冷的50mL离心管(提前加入5mL全培)，如此反复消化4-5次至组织成半透明状时终止；将收集的液体以1 000 r/min、10分钟离心后弃上清液，加入适量全培重悬细胞沉淀，将混匀的细胞悬液转入75 cm2培养瓶中，差速培养90分钟后取出，将培养瓶中细胞悬液倒入加样槽，加终浓度为0.1 mmol/L 5-溴脱氧尿嘧啶，吹匀后继续移入75 cm2培养瓶中培养，差速培养后75 cm2培养瓶中贴壁细胞为内皮细胞，加入适量全培继续培养。传代：将原代心肌培养3天后，镜下观察心肌成簇状或单层，搏动，频率为80～120次/min，传代时，弃去培养液，加适量PBS清洗3次，加4mL0.25%胰酶，镜下观察1分钟至细胞大部分收缩，拍打培养瓶底部，细胞脱落后迅速倒入离心管(提前加入5mL全培)，离心 800 r/min，8分钟，弃上清，以全培重悬细胞，此为第一代细胞。内皮细胞传代过程与心肌细胞基本相同，本实验用第一代心肌细胞及稳定生长的第三代内皮细胞进行实验。

1.3 分组 将心肌细胞分为6组，其中4组嵌套种有内皮细胞的t raswel l小室组成共培养模型，分别为心肌细胞正常组(Cont rol-cm)，心肌细胞损伤组(H/R-cm)，共培养正常组(Cont rol)、共培养损伤组(H/R)、共培养中药预适应组(QSYQ)、共培养缺氧预适应组(HPC)。

1.4 步骤 将心肌细胞以密度2.5×105个/mL种于24孔板，分6组。将内皮细胞以2×105个/mL种于Transwel l嵌套小室内底面［4］，分4组。48小时后镜下观察心肌细胞，24小时后镜下观察内皮细胞，细胞状态良好，同时同步24小时。同步后，各组实验步骤如下：

1.4.1 Cont rol-cm组 换液，于正常孵箱中培养24小时后，继续培养28小时(与H/R同步进行，缺氧箱降到O2＜1%约2h)，取上清液待测。

1.4.2 H/R-cm组 换液，于正常孵箱中培养24小时后放入缺氧箱中缺氧24小时，复氧2小时，取上清液待测。

1.4.3 Control组 取未处理的一组内皮细胞，换新鲜培养液并将嵌套小室放入相应心肌细胞孔中，完成共培养体系，于正常孵箱中共培养24小时后，继续培养28小时，取上清液待测。

1.4.4 H/R组 取未处理的一组内皮细胞，换新鲜培养液并将嵌套小室放入相应心肌细胞孔中，完成共培养体系，于正常孵箱中共培养24小时后，放入缺氧箱中缺氧24小时，复氧2小时，取上清液待测。

1.4.5 QSYQ组 取一组内皮细胞经QSYQ预适应1小时后，将培养液与嵌套小室一同放入相应心肌细胞孔中，完成共培养体系，于正常孵箱中共培养24小时后，放入缺氧箱中缺氧24小时，复氧2小时，取上清液待测。

1.4.6 HPC组 取一组内皮细胞先于缺氧箱中缺氧40分钟，复氧40分钟后，将培养液与嵌套小室一同放入相应心肌细胞孔中，完成共培养体系，于正常孵箱中共培养24小时后，再次放入缺氧箱中缺氧24小时，复氧2小时，取上清液待测。

1.5 检测方法 以CCK-8、SOD评价细胞活力，以LDH、MDA评价细胞损伤程度。

1.6 统计学方法 数据采用SPSS 16.0软件统计分析，计量资料以(χ±s)表示，采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌细胞 CCK-8、SOD、LDH、MDA比较 Cont rol组心肌细胞的细胞活力更好，CCK-8、SOD升高(P＜0.05)；损伤相对减少，LDH下降(P＜0.05)，MDA释放量无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表 1 心肌细胞 CCK-8、SOD、LDH、MDA比较(χ±s)

2.2 与H/R组比较 H/R-cm组心肌细胞活力更低，CCK-8与SOD均下降，损伤更加严重，LDH与MDA均升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；H/R组与Cont rol组比较，细胞处于损伤状态，达到损伤效果，差异有统计学意义(P＜0.05)；经过QSYQ预适应的内皮细胞与心肌细胞共培养后(QSYQ组)，心肌细胞活力高于H/R组，CCK-8与SOD升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，与Cont rol组相当甚至高于Control组；心肌细胞损伤程度低于H/R组，LDH与MDA升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；经HPC处理的内皮细胞与心肌细胞共培养后(HPC组)，心肌细胞亦表现出对长时间缺氧损伤的耐受力，细胞活力高，损伤程度小；QSYQ组与HPC组细胞活力与损伤程度基本相当，见表1。

3 讨论

20世纪80年代后期，研究人员在细胞培养技术的基础上发展了细胞共培养技术［5］。体外细胞共培养体系的建立，可最大程度地模拟体内环境，进而观察细胞之间的相互作用。以往研究表明，在心脏的生长发育、收缩活动及各项生理功能中，心脏内皮细胞相关的自分泌、旁分泌因子以及细胞因子都起着十分重要的调控作用［6］。本实验应用t ranswel l小室建立了心肌细胞(CMC)与心脏微血管内皮细胞(CMEC)的共培养体系，实验结果表明在正常培养情况下，与CMEC共培养的心肌细胞较单一心肌细胞细胞活力更好，而在经过相同长时间缺氧条件下，与CMEC共培养的心肌细胞表现出损伤程度较小的优势，说明共培养体系体现了CMEC与CMC的相互作用，而且共培养的细胞环境较单一细胞更接近心脏内环境条件。

在建立了CMC与CMEC共培养体系的基础上，本实验初步探索经过中药预适应的CMEC对心肌细胞的保护作用，实验结果表明经芪参益气滴丸预适应的CMEC与经过缺氧预适应的CMEC对心肌细胞长时间缺氧损伤方面表现出了同样的延迟保护作用。芪参益气滴丸由黄芪、丹参、三七、降香油4味药物组成，主治气虚血瘀型胸痹心痛，剂型稳定，疗效可靠，是已经上市的中成药，也是体现中医诊治冠心病特色和优势的代表药物之一。本实验仅对CMEC进行芪参益气滴丸预适应，发现对心肌细胞同样具有保护作用。基于心肌缺血预适应的作用机制［7］，本研究发现芪参益气滴丸中的丹参成分主要为脂溶性丹参酮和水溶性丹酚酸两大类［8］，有研究显示丹参酮ⅡA能增加内皮细胞NO的分泌［9］，同时缺血预适应是通过NO介导产生对心肌的延迟保护［10-11］。由此可以推测中药预适应的作用机制可能是CMEC预适应后产生大量内源活性物质分泌到共培养的环境中，这些内源活性物质同NO一样在某个环节中激发了心肌细胞的预适应系统，从而对心肌细胞产生作用，其作用机制有待进一步研究。

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