刺参性腺中6种磷脂含量的HPLC-ELSD分析

朱瑶，陈慧民，卢航，高铭阳，温馨，胡建恩

(大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁大连116023)

中国共有140多种海参，其中大约有20种可食用［1］。海参含有丰富的蛋白质、脂肪、微量元素、黏多糖、脂肪酸，是滋补珍品。国内外有大量关于海参体壁营养成分的研究报道，但关于海参加工副产物的研究较少。海参性腺又称为海参花，是高级美味的食材。与海参体壁相比，海参性腺中还含有丰富的性腺色素、磷脂等，但对海参性腺磷脂的研究目前却尚未见报道。

海洋磷脂是重要的功能性组分，以磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺为主。海洋磷脂中含有大量二十二碳六烯酸 (DHA)和二十碳五烯酸 (EPA)等ω-3不饱和脂肪酸［2］，具有较高的生物活性。磷脂分析常用的方法有薄层色谱 (TLC)、高效液相色谱(HPLC)、质谱 (MS)、气质联用 (C-MS)技术等，随着质谱技术的发展，更为强大的LC-MS方法也用于磷脂的定向定量分析中。LC-MS方法不仅能将磷脂组间分离定量，还有助于检测未分离的同类磷脂化合物［3-4］。HPLC是目前磷脂分离和定性定量分析中最常用的方法，紫外检测器 (UV)和蒸发光散射检测器 (ELSD)是常用检测器。其中，ELSD的响应信号独立于分子中的双键数目，也比UV检测器更为灵敏，并且ELSD在梯度洗脱程序中能提供稳定的基线［5］，因此，ELSD越来越多地用于磷脂的高效液相色谱分析。

正相色谱分离不同种类的磷脂主要基于头部基团极性大小;而反相色谱分离磷脂主要基于磷脂上脂肪酸酰基链的疏水性不同。但相比而言，后者一般分离度较差，峰重合严重［3］。正相色谱分析磷脂的流动相一般分为两类:正己烷-异丙醇-水体系和氯仿-甲醇-水 (氨水)体系。前者多使用等度洗脱，分离过程中往往存在分离时间长、峰形扩散严重、定量不稳定等问题［6］;而后者因氯仿本底吸收很高，故搭配ELSD检测器进行梯度洗脱，对磷脂的分离效果较好。Narváez-Rivas等［7］使用氯仿-甲醇-水体系，加入三乙胺和氨水调节pH，对伊比利亚猪皮下脂肪中的心磷脂 (CL)、磷脂酰乙醇胺 (PE)、磷脂酰肌醇 (PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰胆碱 (PC)、鞘磷脂 (SM)和溶血磷脂酰胆碱 (LPC)等7种磷脂进行了分析，均分离良好，定量稳定。但是高效液相色谱仪中存在聚合物材质的配件在氯仿中可能发生溶胀或收缩，影响机器的气密性和使用寿命。本研究中，使用聚醚醚酮(PEEK)作为正相整体硅胶柱的包覆材料，为了保护高效液相色谱仪及硅胶柱，选择正己烷-异丙醇-水体系作为流动相梯度洗脱，对刺参性腺中的磷脂组成进行分析，旨在为刺参性腺中磷脂的测定提供一种简单、快捷、准确的分析方法，也为刺参性腺的加工利用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

刺参性腺由大连滨海海洋生物有限公司提供，于-20℃下保存备用。

PC、PE、PI、PS、SM、LPC标准品购自美国Sigma公司;正己烷、异丙醇均为色谱级，购自瑞典Oceanpak公司;氯仿、甲醇、冰乙酸等其他试剂均为分析纯。高效液相色谱仪为日立LaChrom Elite系列，色谱柱为默克公司ChromolithⒸPerformance-Si型正相硅胶色谱柱 (100 mm×4．6 mm)，蒸发光检测器为Alltech 2000。

1.2 方法

1．2．1 总脂的提取 刺参性腺总脂的提取根据Folch等［8］的方法稍作改进。将刺参性腺用流水解冻，使用高速组织匀浆机进行匀浆。取小部分匀浆液进行水分含量的测定，其余匀浆液以1∶10(g∶mL)的比例与氯仿-甲醇 (体积比为2∶1)溶液混合，搅拌，静置10 min后抽滤，收集滤液，对滤渣重复两次上述操作。将上述所得滤液合并至分液漏斗中，加入1/5体积的0．9%NaCl溶液，振荡摇匀后静置过夜，收集下层氯仿层，通过无水硫酸钠脱水后，于45℃下真空旋蒸至干，旋蒸瓶中残余物即为刺参性腺总脂。

1．2．2 磷脂的纯化 取100 g硅胶湿法装柱，待柱子平衡过夜后，称取刺参性腺总脂约600 mg用少量氯仿溶解后上样，依次用5倍柱体积的氯仿洗脱中性脂，3倍柱体积的丙酮洗脱糖脂和色素，再用甲醇将磷脂洗脱下来［2，9］，分别收集并称重，记录各部分含量。将磷脂溶于氯仿中，于-20℃下保存备用。

1．2．3 HPLC-ELSD磷脂样品的制备 吸取适量柱层析刺参性腺磷脂样品 (PLs)氯仿溶液，用氮气吹干后精确称取残余物质量，按照一定浓度溶解于HPLC级正己烷-异丙醇 (体积比为3∶1)混合液中。使用前用0．22 μm孔径的有机相滤膜过滤。

1．2．4 刺参性腺磷脂的高效液相色谱分析 用高效液相色谱仪搭配Alltech 2000蒸发光检测器，采用三元梯度洗脱，流动相A为正己烷 (含0．04%三乙胺)，流动相B为异丙醇，流动相C为13%乙酸溶液，洗脱流速为1．5 mL/min，柱温25℃［10］。梯度洗脱程序如表1所示。

表1 梯度洗脱流动相组成Tab.1 Composition of ternary gradient mobile phase

蒸发光检测器采用分流模式，以空气作为雾化气，气体流速为1．7 L/min，漂移管温度为45℃。将PE、PI、PS、PC、SM、LPC标准品配制成浓度为0．6～1．0 mg/mL的溶液，分别单独进样，记录出峰时间，以对刺参性腺中的磷脂进行定性。同时将磷脂标准品溶液梯度稀释进样，以磷脂标品含量为横坐标，对应的峰面积为纵坐标制作标准曲线，利用外标法对刺参性腺磷脂中6种磷脂进行定量。同时，对PE、PI、PS、PC、SM、LPC 6种标准样品同一浓度重复进样3次，记录峰面积，计算各类磷脂峰面积的平均值、相对标准偏差与变异系数。

2 结果与分析

2.1 刺参性腺中脂质的基本组成

经测定，刺参性腺中总脂含量为 (16．33±0．42)%(干质量)，其中磷脂占总脂的 (49．31±0．76)%，糖脂和色素的含量为 (42．11±0．89)%，而中性脂仅占 (8．09±0．93)%。因此，刺参性腺脂质具有低胆固醇、高磷脂、高糖脂的特性，具有良好的开发应用前景。

2.2 混合磷脂标准品及刺参性腺磷脂的高效液相色谱分析

按洗脱程序，PE、PI、PS、PC、SM 和 LPC标准品混合物以及刺参性腺磷脂样品均能达到基线分离 (图1、图2)且峰形良好，成单峰。每次分析均能在15 min内完成，平衡9 min后进下一样品。ELSD的输出信号与进样量的对应关系比较复杂，故HPLC-ELSD用于定量分析不能采用面积归一法。理论上，ELSD响应值与样品质量为y=axb的指数函数关系，也有研究发现，在一定浓度范围内，ELSD 的响应值与样品质量呈线性相关［2，7］。本试验中在以下标准品浓度范围内梯度稀释进样:PE(0．25～20．00 μg)，PI(0．13～10．00 μg)，PS(0．50～ 16．00 μg)，PC(0．44 ～ 35．00 μg)，SM(0．06～6．00 μg)，LPC(0．50～20．00 μg)。以标准品含量为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，以y=axb指数函数模型和y=a+bx线性关系模型分别进行拟合，结果两种模型的R2均大于0．99。

图1 6种磷脂混合标准品HPLC-ELSD图谱Fig.1 HPLC-ELSD profile of six phospholipid standards

图2 刺参性腺磷脂HPLC-ELSD图谱Fig.2 HPLC-ELSD profile of phospholipids in gonad of sea cucumber Apostichopus japonicus

从表3可见，y=a+bx模型较y=axb模型拟合得更好。即在本研究选择的浓度范围内，ELSD检测器的输出信号与进样量之间的关系是符合线性关系的，故选择y=a+bx的线性关系模型作为磷脂定量的标准曲线，对刺参性腺中各类磷脂进行定量。

表3 磷脂标准曲线方程及R2值Tab.3 Calibration curves and R2of the phospholipid standards

表4列出了磷脂标准品重复3次进样的峰面积的平均值、相对标准偏差、变异系数值。由此可知，所有磷脂标准品的峰面积重现性很好，变异系数值均小于3．5%。

表4 磷脂标准品峰面积的重现性Tab.4 Reproducibility of detector response of phospholipid standards

2.3 刺参性腺磷脂样品分析

经计算，刺参性腺中 PE、PI、PS、PC、SM磷脂的含量分别为(1．884±0．023)、(0．274±0．003)、 (0．847 ± 0．019)、 (4．637 ± 0．106)、(0．023±0．002)g/kg(磷脂样品)，LPC 未检出。PC、PE和PS 3种磷脂的含量较高，总含量达到7．368 g/kg(磷脂样品)，其中 PC含量最高，为4．637 g/kg(磷脂样品)，占总脂的22．86%，占性腺干质量的3．73%。本试验中，除去已知的6种磷脂，刺参性腺磷脂中还存在其他两种磷脂组分X1、X2，参考其他磷脂分析文献，这两种磷脂可能是磷脂酸 (PA)和磷脂酰甘油 (PG)，但也有文献指出，可能存在与磷脂酰乙醇胺极性极为相近的缩醛磷脂酰乙醇胺 (pPE)［11］。对刺参性腺磷脂组成的分析还有待进一步研究。

3 讨论

海参性腺是一种珍贵的食材。研究发现，刺参性腺脂质的脂肪酸组成中不饱和脂肪酸达到73．2%［12］，而其中的脂质又多以磷脂的形式存在，因此，对刺参性腺中磷脂的研究具有重要的意义。磷脂本身作为功能性脂质，在生命代谢活动中有极其重要的作用，可以调节脂质代谢，降低血脂中甘油三酯和胆固醇水平。多烯磷脂酰胆碱为磷脂的一种，已在临床上作为肝病辅助治疗药得到广泛利用［13］，磷脂生物活性包括减肥、抗癌、降血糖等［14-16］，也必将越来越受到人们的重视。

对于刺参性腺所含磷脂的分析方法，从分离体系来看，正相整体硅胶柱由整片硅胶制成，不同于传统硅胶柱由硅胶颗粒填充，因此，整体柱在一定程度上可以避免柱床塌陷的问题。而且整体柱具有更高的孔隙度 (20 nm的大孔径和13 nm的中孔径)，允许流动相在低压下获得很高的流速，最高可达9．0 mL/min，且不容易发生堵塞柱子的情况［5］。国外已有学者将整体柱用于磷脂的分析［5，7，17］，国内尚未见相关报道。本研究中，利用正相整体硅胶柱为固定相，正己烷-异丙醇-乙酸水体系为流动相进行梯度洗脱，与国内外常用的磷脂分析方法相比，该方法可以在15 min内对6种磷脂组分同时进行分析，且分离效果良好，也可以应用于其他来源的磷脂成分检测。

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