利用Bayesian方法进行牙鲆体质量和主要形态性状的QTL定位及互作分析

崔妍，高会晓，仇雪梅、2，杨润清，刘海金

(1．大连海洋大学水产与生命学院，辽宁大连116023;2．大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连116023;3．中国水产科学研究院，北京100141)

牙鲆Paralichthys olivaceus隶属于硬骨鱼纲、鲽形目、鲽亚目、牙鲆科、牙鲆属，属暖温性底层海鱼，体侧扁，呈长卵圆形［1］。牙鲆具有个体硕大、肉质细嫩鲜美、易消化、营养价值高的特点，深受消费者的喜爱。目前，牙鲆的自然资源衰退严重，因此，进行大规模的人工养殖势在必行［2-3］。从20世纪60年代起，牙鲆的大规模养殖技术逐渐由日本发展到其他亚洲国家，如中国和韩国等［4］。在中国，牙鲆的人工繁殖发展迅速，在山东、河北、辽宁等地均实现了规模化的人工养殖。牙鲆养殖在快速发展的同时，高密度集约化方式使得牙鲆的死亡率增加，生长速度下降，造成了产业的停滞。因此，进行牙鲆优良品种和家系的选育，对于进一步提高产量和品质具有重要的意义。

鱼类育种中所研究的经济性状如产量、品质、抗性等大多数的性状属于数量性状，由多基因控制，易受环境影响。通常利用表型选择和分子标记辅助选择 (marker-assisted selection，MAS)技术来提高质量性状和数量性状的选择效率。MAS技术可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。数量性状位点 (quantitative trait locus，QTL)能在应用MAS技术分析性状时识别控制目标性状的基因在基因组中的位置。进行QTL定位之前需要一个由大量且密集的分子标记绘制的遗传连锁图谱。2003年，Coimbra等［5］绘制出了第一个牙鲆回交群体的基因图谱，该图谱包括111个微卫星标记和346个扩增片段长度多态性 (amplified fragment length polymorphism，AFLP)标记。随后，Kang等［6］于2008年利用微卫星分子标记 (simple sequence repeats，SSR)构建了褐牙鲆的遗传连锁图谱。目前，牙鲆的二代遗传连锁图谱已经完成，平均标记距离在2 cm以下［7-8］。遗传连锁图谱在基因定位，检测基因与性状之间的关系，研究基因组结构、组织和进化功能等方面有很大作用［9］。

数量性状的遗传结构包括QTL的数目、位置、主效应、上位显性效应和QTL与环境的互作效应。由于对QTL数量的未知和上位显性效应的巨大，使得对数量性状遗传结构的剖析变得非常复杂。为了解决这个难题，可以在这些未知参数基础上，通过联合后验分布产生后验样本，再利用Bayesian定位方法来估计这些参数。作为Bayesian定位方法中的一种，Bayesian模型选择方法在解决复合空间的问题方面有一定的效果［10-11］。Bayesian模型选择方法是一种有效并且相对简单的识别复杂性状上位QTL定位方法。该方法除了可以用来分析主效应QTL之外，还可以用来剖析互作效应QTL。Liu等［12］在2013年构建了一个通过有丝分裂雌核发育而得到牙鲆的双单倍体 (Doubled haploids，DH)群体，同时测量了2龄时每个牙鲆个体的体质量和多个形态性状。理论上，由雌核发育制备的双单倍体会受近交导致的有害纯合突变的影响，这些突变通常会在胚胎的早期发育过程中显现出来，导致DH后代的存活率较低［13］。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用牙鲆采自中国水产科学研究院北戴河中心试验站。数据的收集 (包括体质量和形态性状的测量，基因型的筛选)也是由中国水产科学研究院北戴河中心试验站完成。

1.2 方法

1．2．1 DH群体 用经过紫外线 (UV)照射的红鲷鱼 (真鲷鱼)精子激活牙鲆卵细胞，然后静水压处理 (以阻止第一次有丝分裂)，进而得到双单倍体的牙鲆受精卵［14］。选取理想的牙鲆个体，杂交产生F1代，再选取一尾雌鱼作为诱导DH群体的亲本进行有丝分裂雌核发育。该试验群体包含157个DH个体，都是由该雌鱼的卵子培育而成。在雌核发育中，精子可以正常的钻入和刺激卵细胞，但由于精子是经过处理的，精子的细胞核并未参与卵细胞的发育，不会对后代有遗传贡献。本试验中，用红鲷精子代替牙鲆精子来激活鲆卵的发育，可以确保存活的后代都属于真正意义上的雌核发育。

1．2．2 性状测量 在牙鲆2龄时，测量牙鲆DH群体中157个个体的体质量和形态性状。用2-苯氧基乙醇麻醉每个个体，分别移到同一个板上称重并记录，确保所有数据的真实性且误差最小，同时测量每条鱼的实际长度。测量结果包括体质量和全长、体长、头长、尾柄长、背鳍基长、腹鳍基长等11个形态性状，测量的位置示意图见图1。

图1 牙鲆体尺性状测量标准Fig.1 Measurement standards of morphological traits in Japanese flounder Paralichthys olivaceus

1．2．3 遗传连锁图谱 遗传连锁图谱有助于深入开展各生物种类的分子生物学和基因组学研究。本研究中，用622个 (481个 II型 SSRs和 141个EST-SSRs)多态性SSR标记，并利用Joinmap 4．0软件来构建牙鲆遗传连锁图谱。图谱总长度为1214．7 cm，相邻的单一标记位点之间的平均间隔为2．65 cm。该图谱中有574个标记定位在458个单一位置上，并且分布在24个连锁群上，同时还有48个标记没有定位到任何连锁群上。用卡方检验统计推断这些标记，50%左右的标记表现出偏分离，不符合1∶1的Mendelian分离比。偏分离对QTL的显性效应有较大影响，但不总是影响QTL的加性效应［15］。由于所分析的DH牙鲆群体只有加性效应，因此，在进行QTL定位和互作分析时，将所有的标记考虑在内。

1．2．4 QTL定位 在牙鲆DH群体中，每个位点只有加性效应和不同位点之间的互作效应。假设每个位点的两种基因型分别用QQ和qq表示，在Cockerham's遗传模型［16］基础上建立一个遗传定位模型，用来分析单性状中QTL和互作的QTL，模型如下:

其中:yi为DH群体的第i个个体的表型值;μ为群体平均值;q为QTL的个数;aj为第j个QTL的加性效应 (j=1，2，…，q);zij为第i个个体的第j个位点的基因型指数;aa为第j个和第k个QTL加性效应的乘积;xijk=zij×zik;ei为剩余误差。

在上述模型的基础上，利用 R/qtlbim(www．qtlbim．org)安装包［17］，采用 Bayesian 模型选择方法［10-11］，对体质量和形态性状进行全基因组的互作分析。根据2013年Liu等［12］区间作图的结果，分别将主效应QTL和上位QTL的预期数目设定为4和5，因此，QTL数目的上限为9+3 9=18。在对每个性状应用MCMC算法时，第10 000轮作为burn-in被去掉，以使Markov链正确混合。然后，对每个观测值跑40轮，产生3000个相对独立的样本后，推断所分析性状的遗传结构，总共跑1．3×105轮。

2 结果与分析

用Bayesian因子BF［18］作为推断每个位点的主效应，在显著性水平0．05上，BF的阈值为3或2lnBF值超过2．1即为主效应。表1和表2分别为体质量和11个形态性状的主效应QTL和互作QTL的定位结果及其遗传参数。

2.1 体质量

体质量性状中检测到了一个主效应QTL，该QTL对体质量性状具有负向加性作用，它解释的表型变异的联合效应为1．6%(表1);体质量性状中还检测到5对互作效应，其中3对互作效应表现出非常强的加加上位性效应，说明这3对互作QTL对体质量影响最大，分布在21和23号染色体上的一对互作QTL贡献率较大 (23．1%)，而其他互作QTL的贡献率较低 (7．0%～8．7%)(表2)。

2.2 纵向性状

全长、头长、体长、尾柄长、尾长、腹鳍基长、背鳍基长7个形态性状都属于纵向性状。根据其主效应QTL的个数，将其分为三类:

(1)尾长 (CL)、全长 (TL)和腹鳍基长(PFL)中各自检测到两个主效应QTL，其中，全长和腹鳍基长性状中分别都有一个位于6号染色体上的QTL，且效应都为负 (表1)。3个性状的互作结果表明，只有尾长中的两对互作效应较小，其他均在10%左右 (表2)。

(2)体长 (BL)和背鳍基长 (DFL)，在这两个性状的6、9、22号染色体上各发现了1个主效应QTL，除了位于22号染色体上的QTL外，其他QTL对所在性状产生负的加性效应，这些QTL所解释的表型方差在2．3%～8．6%(表1)。在这2个性状中分别检测到4对和5对互作QTL，只有分布在6号和17号染色体上的一对互作QTL对背鳍基长有较高的加加上位性效应 (表2)。

(3)头长 (HL)和尾柄长 (CPL)中检测主效应QTL的个数都≥4个，它们所解释的表型变异联合效应值都在17%左右 (表1)。头长和尾柄长中各发现3对和4对互作QTL，互作贡献率都为10%左右 (表2)。

表1 利用Bayesian模型选择法分析牙鲆体质量和形态性状的主效应QTL及其遗传参数Tab.1 Main effect QTL and genetical parameters of body weight and morphobological traits in Japanese flounder Paralichthys olivaceus detected by Bayesian model selection

表2 牙鲆体质量和形态性状的上位显性基因互作效应Tab.2 Epistatic effects for body weight and morphobological traits in Japanese flounder

2.3 垂直性状

除了上述性状外，头高、体高、尾高、尾柄高4个形态性状都属于垂直性状。

(1)在头高 (HW)和体高 (BD)中，各发现了两个主效应QTL，其中3个为正的加性效应，1个为负的加性效应 (表1);在这2个性状中共检测到10对互作QTL(表2)。

(2)控制尾高 (CW)性状的4个主效应QTL分别位于5、7、8、13号染色体上，单个QTL贡献率分别为 2．1%、1．6%、0．7%、0．8%(表 1);在尾高中检测到5对互作QTL，它们的互作贡献率为 7．6%～13．3%。

(3)所分析的性状中，尾柄高 (CPW)中所检测到的QTL个数最多，共有6个，单个QTL解释的表型方差为0．5%～8．9%(表1);同时还发现了4对互作的QTL，每对互作QTL的贡献率都在10%左右 (表2)。

2.4 多效性的QTL

在定位结果中可见多个 QTL共定位现象，位于6［0．0］的主效应 QTL分别控制体质量、全长、体长、尾柄长、背鳍基长、体高、尾柄高、头高，且大部分的效应方向相同，另外还发现了8个主效应QTL表现出多效性 (表1)。同时，在互作分析结果中也发现了多效性，分布在6［61．0］×9［93．3］的互作 QTL，在全长、体长、头长、腹鳍基长、尾柄高、头高、尾长中都发挥了重要的作用(表 2)。

3 讨论

目前，关于牙鲆QTL定位方面的研究还比较少。Song等［8］于2012年建立了一个半年生的全同胞牙鲆家系群体，并对所有个体的体质量和体宽两个性状值进行了测量。随后选用WinQTLCart 2．5软件的复合区间作图 (CIM)方法对该群体进行了QTL定位研究，在两个性状中分别定位了1个和3个主效应QTL，并且都位于14号连锁群上。2013年，Liu等［12］应用MapQTL软件的多QTL定位模型(MQM)［19-20］对2龄DH牙鲆群体的体质量和形态性状进行了QTL定位研究。本研究中，利用R/qtlbim(www．qtlbim．org)安装包［17］，采用 Bayesian模型选择方法［10-11］，对2龄DH牙鲆群体的体质量和11个形态性状进行QTL定位分析。虽然Song等［8］和本研究中都对体质量性状进行了QTL研究，然而定位到的QTL并不相同。与Liu等［12］的定位分析相比，本研究与Liu等［12］所研究的都是2龄DH牙鲆群体，同时在两种定位分析中，都对头长、尾柄长、尾柄高这3个性状进行了分析，都在这3个性状中分别定位到了相同的主效应QTL(位于相同染色体上的同样的位置)，说明这些主效应QTL对相应性状的效应极其显著且易被检测到。综上，在QTL定位研究中，研究群体的不同及所使用定位软件的不同都会造成定位结果的差异。

本研究中同时发现了50对上位互作效应，所解释的表型方差范围为2．3%～23．1%，这个结果比主效应所解释的百分比要高，说明这些性状的遗传结构比较复杂。本研究中发现主效应和互作效应有以下规律:

(1)主效应中检测到QTL参与上位性互作效应;

(2)主效应中未检测到的QTL出现在上位性互作效应中，但发现一个QTL与多个QTL有互作关系。

关于互作QTL的定位方面的研究会增加对于遗传标记与所研究性状之间相关信息的了解，也可以提高鉴定生长基因的效率［21］。在牙鲆育种过程中，通过标记辅助选择，有用的遗传变异可以推进遗传研究的进展。

相关的性状一般共定位在同一个连锁群或同一个联锁区间上。多数情况下，相关性状出现共定位的QTL可能是一因多效的结果，也可能是由于性状之间相互依赖的结果［22］。关于多效性的分子机制的研究结果表明，多效基因主要是基因产物等单个分子活动的结果，而不是同一个基因产物参与多个分子过程［22］。本研究中，利用Bayesian模型选择方法分析12个性状后，发现8个主效应QTL和7对互作效应 QTL具有多效性。此外，在应用Bayesian模型选择方法分析多个性状时，如何更有效、准确地定位QTL还需进一步研究。

目前，关于如何应用QTL定位和互作效应分析来选择遗传稳定、贡献率高的QTL以提高牙鲆经济性状的稳定遗传和表达的研究越来越多。优先选择与主效应QTL紧密连锁的分子标记进行标记辅助选择，对有效地认识数量性状的遗传机制，进一步精细定位、克隆与分子设计育种可提供便利［23］。随着分子标记和QTL分析技术的不断成熟与发展，分子标记辅助育种在牙鲆养殖中的应用也展现出诱人的前景。

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