芪参补气药茶清除线粒体活性氧研究

李兴太，韦豪华，张红玲，孙海波，苏亚茹

(大连民族大学 生命科学学院，辽宁 大连116605)

近年发现，活性氧(ROS)参与了100 多种人类疾病，如心血管疾病、糖尿病、慢性炎症、神经退行性疾病和癌症的发病机制及免疫和衰老过程［1-4］。线粒体是机体进行各项生命活动的枢纽和核心，最主要功能就是通过氧化磷酸化(OXPHOS)提供生命活动所需能量——三磷酸腺苷(ATP)。线粒体又是ROS 损伤最敏感的靶部位，被称为衰老的“生物钟”，2013 年线粒体功能障碍被Cell 杂志列为衰老的九大标志之一［5］。主要由线粒体ROS 引起的蛋白质、核酸与脂质氧化，是决定健康和寿命的关键因素［6］。ROS 生成与清除之间保持平衡(氧化还原平衡)对健康具有重要意义［7］。近几十年的研究已经凸显出ROS 在健康和疾病中新的角色。

祖国医学认为，“气者，人之根本也”;“百病皆生于气也”;气与健康、疾病和生命关系极为密切。随着年龄的增长气虚呈逐年加重之势，中国的中老年人中一半以上表现为气虚，气虚亦是多种病变的常见病因，补气是治疗气虚之大法，补气在中医养生及临床上占有重要地位。LI Xing -Tai 发现，气虚导致显著的细胞内ATP 水平下降及一磷酸腺苷(AMP)水平上升，受损的线粒体ATP 生成是气虚的关键特性，气虚可导致线粒体能量代谢障碍，提出并实验证明“补气作用是通过改善线粒体能量代谢实现的”［8］。

黄芪(Astragalus membranaceus)和党参(Codonopsis pilosula)是补气药的代表。黄芪不仅有补气、“扶正”作用，而且气血阴阳兼而有之，故有“补药之长”之称。党参补中益气、养血生津，为滋养脾胃之要药，用于神疲力乏、脾胃虚弱等症。党参能增强线粒体功能并改善能量代谢，对解除运动性疲劳有重要作用［9］。我们的前期研究证明，黄芪和党参均能显著增加鼠肝细胞ATP 含量、腺苷酸池(TAP)与腺苷酸能荷(AEC)水平［10］;黄芪多糖能通过清除ROS、抑制线粒体通透性转换(MPT)及提高抗氧化酶活力来保护线粒体免受损伤，且能通过提高细胞的生物能学而改善线粒体功能［11-12］。黄芪补气之功最优，常与党参同服，则补气之力更佳，故选黄芪与党参配伍以加强补气之力，组方制成“芪参补气药茶”，定会受到广大消费者的青睐，但其作用机理尚不清楚。药茶，药以茶而现，茶以药为用，说明药、茶原为一类，其功能优势可以互补。

本实验从清除线粒体ROS 视角研究芪参补气药茶的作用机理，为进一步开发利用黄芪、党参的药用及保健功能提供科学依据，以拓宽保健药茶更广阔的市场应用前景。

1 材料及方法

1.1 材料

黄芪采自大兴安岭林区，党参购自大连开发区保健大药房。

1.2 仪器及试剂

Polystat 34 恒温水浴锅(美国Techne 公司);UV-2450 紫外-可见分光光度计(日本岛津公司);DY89 -1 型电动玻璃匀浆机(宁波新芝科器研究所);XW-80A 旋涡混合器(上海精密实业有限公司)。

考马斯亮蓝G -250、吩嗪硫酸甲酯(PMS)(美国Fluka 公司);还原型辅酶Ⅰ(NADH)与氮蓝四唑(NBT)(荷兰Boehringer Mannheim 公司);三羟甲基氨基甲烷(Tris)(美国Gibco 公司);其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.3 方法

1.3.1 芪参补气药茶(ACT)的制备及其总黄酮与多糖含量的测定

称取干燥黄芪粉末、党参饮片各25 g 加入500 mL 去离子水浸泡1.0 h 后煮沸30 min，滤出煎液，然后向药渣中加入400 mL 去离子水再煮沸20 min，得煎液，将两次所得煎液合并浓缩至500 mL，装瓶密封，即得到生药质量浓度为100 mg ·mL-1的芪参补气药茶，置于4℃冰箱中保存备用。以芦丁为标准品用AlCl3比色法测定ACT 总黄酮［13］;ACT 经Sevage 试剂(氯仿与正丁醇的体积比为4∶1)除蛋白，浓缩，加入无水乙醇使其体积分数为80 %，离心，所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚分别洗涤，沉淀即为ACT 总多糖，真空干燥，以葡萄糖为标准品用硫酸苯酚法测定ACT 总糖和总多糖含量［14］。

1.3.2 超氧阴离子(O2·-)的测定

以NADH/PMS 为O2·-生成系统，以NBT 还原法测定O2·-的生成情况［15］。16 mmol·L-1的Tris-HCl 缓冲液(pH8.0)中含NADH 73 μmol·L-1、NBT 50 μmol·L-1、PMS 15 μmol·L-1，空白管不加PMS，对照组不加ACT，总体积为3 mL，以空白管调零，于波长560 nm 处测定吸光度，2 min 时准确记录数据，并按式(1)计算清除率(SR)，以VC 为阳性对照。

1.3.3 羟自由基(·OH)清除活性分析

总体积2 mL 的Fenton 反应体系含0. 75 mmol·L-1硫酸亚铁、0.75 mmol·L-1邻二氮菲、150 mmol·L-1PBS 和不同浓度的ACT 或BHT、0.8 mmol·L-1H2O2。加入H2O2起始反应，各管分别在37 ℃水浴中孵育60 min，测定波长536 nm处Fe2+-邻二氮菲复合物吸光度［16］。以BHT 为阳性对照。按式(2)计算ACT 对·OH 的清除率。

式中，A0为对照组(加H2O2但不加ACT 和BHT)吸光度;A1为ACT 或BHT 组吸光度;A2为空白组(不加ACT、BHT 和H2O2)吸光度。

1.3.4 H2O2的测定

ACT 的H2O2清除活性按Zhao 等［17］方法测定。1.0 mL 0.1 mmol·L-1H2O2与1.0 mL 不同浓度的ACT 混合，再加入100 μL 3 %钼酸铵，10 mL 2 mol·L-1硫酸和7.0 mL 1.8 mol·L-1碘化钾。混合溶液用5 mmol·L-1Na2S2O3滴定至黄色消失，以BHT 为阳性对照。按式(3)计算清除率。

式中，V0为H2O2存在时滴定对照样品(不含ACT)使用的Na2S2O3溶液体积;V1为ACT 或BHT 存在时使用的Na2S2O3溶液体积。

1.3.5 统计学处理

2 结果与分析

2.1 芪参补气药茶(ACT)总黄酮与总多糖的含量测定结果

研究表明:党参主要活性成分有多糖、黄酮、酚酸等，党参多糖具有清除超氧阴离子和羟自由基、增加SOD 并抑制脂质过氧化的活性，其含量的高低可作为党参的质量评价指标，多糖为党参的主要功能因子［18-19］;黄芪主要含多糖、黄酮和皂苷等活性成分，具有增强免疫功能、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、延缓衰老等活性，多糖和黄酮为其主要功能因子［20-21］。鉴于黄芪和党参均含较多的糖类物质(包括单糖、寡糖和多糖)，为人类营养所需，其均可能参与机体的能量代谢，是发挥补气作用的重要功能因子;黄酮类物质又具有较强的抗氧化药理活性;因此，本实验测定了ACT的总糖、总多糖及总黄酮含量作为制定其质量标准的依据。取ACT 200 μL，用AlCl3比色法测定ACT 总黄酮质量分数为(121 ±8.5)μg·mL-1。用硫酸苯酚法测定ACT 总糖质量分数为(26 ±1.3)mg·mL-1，总多糖质量分数为(12.5 ±0.8)mg·mL-1。

2.2 芪参补气药茶对O2·-、·OH 及H2O2 清除作用的影响

机体内95 %以上的ROS 源于细胞内氧被消耗的主要部位——线粒体，正是在此，还原性底物提供电子以形成电化学梯度，从而最终导致细胞的能量货币ATP 的生成，这是通过线粒体内膜上一系列蛋白复合体的氧化反应进行的。电子从这些复合体漏出导致氧的单电子还原形成超氧阴离子(O2·-)——大部分ROS 的前体。歧化超氧化物生成H2O2，随后通过Haber -Weiss反应，O2·-与H2O2相互作用或Fenton 反应裂解H2O2形成羟自由基(·OH)［22］。线粒体耗氧的约0.2 %通常在静息状态转化成O2·-［23］。

与对照组相比，ACT 可一定程度清除O2·-、·OH 及H2O2三种ROS，且呈剂量- 效应关系(见表1 -表3)，其清除O2·-作用强度明显弱于阳性对照VC 组;VC 可以通过葡萄糖转运子进入线粒体，并抗氧化损伤以保护线粒体。其清除·OH和H2O2作用强度虽远不如阳性对照BHT强，但BHT 为合成抗氧化剂，有一定毒性，已被限制使用。作为线粒体生物功能的后果，其总是暴露在ROS 产物中，并有一个复杂的抗氧化防御系统以抵抗被氧化。生物系统中氧化剂和抗氧化能力的内稳态被打破时且氧化还原状态更加助氧化时，氧化应激便会发生。因此，在线粒体氧化应激条件下，即线粒体ROS 的生成超过抗氧化能力条件下，线粒体可能遭受对其生物分子的氧化损伤。因此，适量补充外源性活性氧清除剂，可预防这类损伤和病变的发生与发展。

表1 ACT 对O2· -的清除作用(n=6)

表2 ACT 对·OH 的清除作用(n=6)

表3 ACT 对H2O2 的清除作用(n=6)

3 讨 论

氧化与抗氧化平衡是健康的关键。在低剂量时，ROS 对多种生理功能起关键作用，如细胞信号传导、基因表达、免疫反应的调节及促进抗氧化防御机制［24］。完全消除ROS 会抑制机体应答外部应激因素反应的能力［25］。ROS 与抗氧化保护系统必须协调作用，达到氧化还原平衡状态。ROS是一柄“双刃剑”，其在生理浓度时广泛参与细胞的信号转导和生命过程，过量时又能引起线粒体氧化应激，从而导致衰老及相关疾病的发生。如何保持细胞内的氧化与抗氧化平衡(氧化还原平衡)，既不过度氧化损伤，也不过度抗氧化而影响正常的信号转导，这对健康极为重要［7］。

越来越多的证据显示，植物性食物的健康益处可能不会归因于某一个特定的化合物，而是归因于整个水果和蔬菜，即其中的植物化学物质和营养物质复杂的协同作用［26］。因此，本实验以水为溶剂(避免化学溶剂的引入)提取药茶总活性成份，既符合传统饮茶与用药习惯，又综合利用其中的各种营养物质(避免浪费)复杂的协同作用，倡导“传统、自然、简约、有效”的药茶养生保健理念。

ROS 是由分子氧还原产生的高反应性分子。线粒体主要的ROS 有O2·-，·OH 和H2O2三种。这些ROS 主要是由线粒体氧化磷酸化(电子沿呼吸链酶传递并泄漏给分子氧)生成的。本实验结果表明，芪参补气药茶对三种主要ROS 的清除作用不是很强，说明其具有较温和的抗氧化作用，这可能对维持机体的氧化还原平衡具有一定作用，而强抗氧化剂如BHT 等则具有较大的毒性，这也许印证了古代本草著作中记载的补气类中药具有久服无毒、延年益寿的作用。ROS 也可导致线粒体的脂质过氧化及膜通透性增加，而ACT 能够一定程度上清除三种主要线粒体ROS，说明其具有一定的健康益处。ACT 能通过温和的抗氧化作用来保护线粒体，从而维持机体氧化与抗氧化平衡，这是ACT 促进健康的潜在机制。然而，其对线粒体功能影响的体内实验尚待进一步研究。

［1］TAMURA M，MATSUI H，TOMITA T，et al. Mitochondrial reactive oxygen species accelerate gastric cancer cell invasion［J］. Journal of Clinical Biochemistry andNutrition，2014，54(1):12 -17.

［2］GONCHAROV N V，AVDONIN P V，NADEEV A D，et al. Reactive oxygen species in pathogenesis of atherosclerosis［J］. Current Pharmaceutical Design，2015，21(13):1134 -1146.

［3］NATHAN C，CUNNINGHAM-BUSSEL A. Beyond oxidative stress:an immunologist’s guide to reactive oxygen species［J］. Nature Reviews Immunology，2013，13(5):349 -361.

［4］LIOCHEV S I. Reactive oxygen species and the free radical theory of aging［J］. Free Radical Biology and Medicine，2013，60(10):1 -4.

［5］ LóPEZ - OTíN C，BLASCO M A，PARTRIDGE L，et al. The hallmarks of aging［J］. Cell，2013，153(6):1194 -1217.

［6］DE CAVANAGH E，INSERRA F，FERDER L. Angiotensin Ⅱblockade:a strategy to slow ageing by protecting mitochondria［J］. Cardiovascular Research，2011，89(1):31 -40.

［7］李兴太，纪莹. 线粒体氧化应激与天然抗氧化剂研究进展［J］. 食品科学，2015，36(7):268 -277.

［8］LI Xingtai. Investigation on the Mechanism of Qi-invigoration from a Perspective of Effects of Sijunzi Decoction on Mitochondrial Energy Metabolism［M］∥Sakagami Hiroshi. Alternative Medicine. Rijeka:InTech Publisher.2012:247 -275.

［9］李岩，武乾，林谦. 补气药党参黄芪对慢性心衰大鼠血流动力学的影响［J］. 中国中医基础医学杂志，2010，16(7):597 -598.

［10］LI Xingtai，ZHAO Jia. An Approach to the Nature of Qi in TCM—Qi and Bioenergy［M］∥Kuang Haixue.Recent Advances in Theories and Practice of Chinese Medicine. Rijeka:InTech Publisher. 2012:79 -108.

［11］LI Xingtai，ZHANG Yakui，KUANG Haixue，et al.Mitochondrial protection and anti -aging activity of Astragalus polysaccharides and their potential mechanism［J］. International Journal of Molecular Sciences，2012，13(2):1747 -1761.

［12］LI Xingtai，ZHAO Jia. Cancer-preventive mechanism from the perspective of effects of the Astragalus polysaccharides on mitochondrial energy metabolism improvement［M］// Cancer – Cares，Treatments and Preventions. Brisbane:iConcept Press，2014:141 -180.

［13］王浩江，孙体健，曹晓峰. 月季花中总黄酮含量测定［J］. 山西医科大学学报，2007，38(4):318 -319.

［14］DUBOIS M，GILLES K A，HAMILTON J K，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances［J］. Analytical Chemistry，1956，28(3):350 -356.

［15］FONTANA M，MOSCA L，ROSEI M A. Interaction of enkephalines with oxyradicals［J］. Biochemical Pharmacology，2001，61(10):1253 -1257.

［16］LIN Z，ZHU D，YAN Y，et al. An antioxidant phytotherapy to rescue neuronal oxidative stress［J］. Evidence- based Complementary and Alternative Medicine，2011，2011:519517:1 - 519517:7.

［17］ZHAO G R，XIANG Z J，YE T X，et al. Antioxidant activities of Salvia miltiorrhiza and Panax notoginseng［J］. Food Chemistry，2006，99(4):767 -774.

［18］YONGXU S，JICHENG L. Structural characterization of a water-soluble polysaccharide from the roots of Codonopsis pilosula and its immunity activity［J］. International Journal of Biological Macromolecules，2008，43(3):279 -282.

［19］SUN Y X. Immunological adjuvant effect of a water -soluble polysaccharide，CPP，from the roots of Codonopsis pilosula on the immune responses to ovalbumin in mice［J］. Chemistry ＆ Biodiversity，2009，6(6):890-896.

［20］张冬青，汪德清. 黄芪总黄酮生物学活性作用研究进展［J］. 中国中药杂志，2010，35(2):253 -256.

［21］张蔷，高文远，满淑丽. 黄芪中有效成分药理活性的研究进展［J］. 中国中药杂志，2012，37(21):3203 -3207.

［22］KRIVORUCHKO A，STOREY K B. Forever young:mechanisms of natural anoxia tolerance and potential links to longevity［J］. Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2010，3(3):186 -198.

［23］ST -PIERRE J，BUCKINGHAM J A，ROEBUCK S J，et al. Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain［J］. Journal of Biological Chemistry，2002，277(47):44784-44790.

［24］VALKO M，LEIBFRITZ D，MONCOL J，et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease［J］. The International Journal of Biochemistry ＆ Cell Biology，2007，39(1):44 -84.

［25］SCHMEI ER S，RISTOW M，BIRRINGER M. Recent reassessment of the role of reactive oxygen species(ROS)［J］. Ernaehrungs Umschau International，2013，60(9):162 -167.

［26］LIU Ruihai. Health benefits of fruit and vegetables are from additive and synergistic combinations of phytochemicals［J］. The American Journal of Clinical Nutrition，2003，78(3):517S-520S.