酰化和酶法修饰后牦牛乳酪蛋白热稳定性变化

杨继涛,杨 敏,2,*,张 媛,杨 晰

(1.甘肃农业大学理学院,甘肃兰州 730070；2.甘肃省功能乳品工程实验室,甘肃兰州 730070)



酰化和酶法修饰后牦牛乳酪蛋白热稳定性变化

杨继涛1,杨 敏1,2,*,张 媛1,杨 晰1

(1.甘肃农业大学理学院,甘肃兰州 730070；2.甘肃省功能乳品工程实验室,甘肃兰州 730070)

采用酰化试剂和转谷氨酰胺酶(TG)对牦牛乳中的酪蛋白进行改性,并对改性后的酪蛋白进行热稳定性研究,通过在280nm处测定吸光度值来评价酪蛋白热稳定性。结果表明,酪蛋白经TG交联后热稳定性提高。采用不同酰化试剂修饰后,牦牛乳酪蛋白热稳定性增强,不同改性修饰的酪蛋白热稳定性差异较大,琥珀酸酐修饰酪蛋白热稳定性最强。结果可为牦牛乳酪蛋白修饰和产品开发及利用提供参考依据。

牦牛乳酪蛋白,热稳定性,酰化修饰,交联修饰,谷氨酰胺转氨酶

酪蛋白是牛乳中最丰富的蛋白质,是食品及化学工业重要的蛋白质原料。酪蛋白具有良好的功能性质,如乳化性、发泡性等,因而在食品及非食品工业中具有广泛用途[1-2]。在蛋白质的工业加工过程中,热处理是最常用的操作,这要求蛋白质原料具有较高的热稳定性[3]。影响酪蛋白质稳定性的因素很多,其中外部因素主要有体系pH、温度等,内部因素主要为蛋白质的结构[4-5]。

牦牛乳酪蛋白是青藏高原地区的特色资源,在我国干酪素产业中占有较高市场份额。然而,由于牦牛乳酪蛋白初加工工艺未经严格控制,加工中严重破坏了酪蛋白的天然结构,致使其功能性质变差[1]。

提高蛋白质的功能性质对工业化加工具有重大意义,结构修饰是提高蛋白质功能性质的有效途径。常用于蛋白质结构修饰的方法可分为四类:酶法、化学法、物理法、基因工程法[6-7]。目前,蛋白质的化学修饰相关研究主要集中在酰化修饰方面等。酰化修饰是指蛋白质分子的亲核基团(如氨基或羟基)与酰化试剂之间反应,从而导入新的功能基团的过程。最为常见的酰化试剂为琥珀酸酐、琥珀酸和乙酸酐[2,8-10]。

食品蛋白质酶法修饰主要有酶法交联和酶法水解。谷氨酰胺转氨酶(TG)是一种能催化酰基转移的酶,它可使蛋白质(或多肽)之间发生共价键交联,使蛋白质分子量变大,形成强有力的凝胶,从而改变各种蛋白产品的弹性、保水性、塑性、稳定性等特性,并且引入的赖氨酸残基仍然能被消化利用,不会造成营养价值的降低[6-8]。

本文研究了化学法酰化修饰和酶法交联修饰后牦牛乳酪蛋白的热稳定性,探讨改性手段对酪蛋白热稳定性的影响,为牦牛乳酪蛋白结构修饰及其产品开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牦牛乳盐酸沉淀酪蛋白 购于甘肃华羚生物有限责任公司,经测定其中酪蛋白含量为94.20%,水分含量为3.12%;谷氨酰胺转氨酶(100U/g) 江苏一鸣生物制品公司；邻苯二甲醛(OPA)、丁二酸酐、丁二酸、乙酸酐 天津市凯信化学工业有限公司。

DF-Ⅱ集热式磁力加热搅拌器 金坛市顺华仪器有限公司；pHS-3C实验室pH计 上海三信仪表厂；HWS型电热恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司；AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；TGL-20高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；TDD5M低速离心机 长沙平凡仪器仪表有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶法交联酪蛋白的制备 配制浓度为5mg·mL-1、pH7.0的牦牛乳酪蛋白溶液,在47℃下以15U·g-1·添加TG,磁力搅拌下反应135min。反应结束后,在85℃下灭活5min,冷却后用1.0mol·L-1HCl将溶液的pH调至4.6,酪蛋白沉淀,离心后真空冷冻干燥备用。

1.2.2 酰化酪蛋白的制备 准确称取1.0000g牦牛乳酪蛋白样品,加入100mL去离子水中,在40℃磁力搅拌直至酪蛋白完全溶解。将溶液pH调至8～9,在40℃磁力搅拌下加入0.1、0.2、0.6g琥珀酸酐并不断加入1.0mol·L-1NaOH溶液使反应液pH稳定在8～9,反应50min。用1.0mol·L-1HCl溶液将酰化后酪蛋白溶液pH调至产生大量沉淀,于3500r/min离心15min,弃去上清液,将沉淀置于钢制托盘进行冷冻干燥,得到白色粉末状琥珀酸酐酰化酪蛋白制品,备用。以不加酰化试剂的样品作为对照,处理方法同上。

琥珀酸、乙酸酐酰化酪蛋白制备方法同上,乙酸酐用量为0.56mL,琥珀酸用量为1.5g。

1.2.3 酰化程度及交联程度测定 牦牛乳酪蛋白酰化程度参照杨敏的方法[1],采用邻苯二甲醛法测定。准确称取40mg OPA,溶于1mL乙醇；配制25mL浓度为0.1mol·L-1、pH为9.3的硼砂缓冲溶液；移取2.5mL 20%的SDS溶液,与上述溶液混合并用蒸馏水稀释至50mL。准确移取3mL浓度为0.2mg·mL-1的酪蛋白溶液,与3mL上述OPA溶液混合,充分震荡并放置2min后采用紫外-可见分光光度计于340nm测定吸光度值。游离氨基含量采用亮氨酸标准曲线进行计算。

酪蛋白酰化程度及交联程度采用下式计算:

修饰程度(Modification degree,%)=(No-Nm)/No×100

N0和Nm分别为酰化前后酪蛋白游离氨基含量。

1.2.4 酪蛋白样品热处理 将浓度为2mg/mL、pH7.0的样品溶液30mL,分别在40～90℃下加热20min,冷却至室温后,40000g条件下离心35min,稀释后280nm下测定上清液的吸光度,根据吸光度值的大小判定溶液的热稳定性。

1.2.5 热稳定性的测定 溶解各酪蛋白样品使其质量浓度为0.5mg·mL-1,pH7.0,溶液分别在40～90℃下加热20min,冷却至室温后,8000r/min条件下离心20min,上清液过滤,在280nm下测定上清液的吸光度,根据吸光度值的大小判定溶液的热稳定性[11]。上清液吸光度值越大,说明溶解的蛋白质越多,沉淀的蛋白量越少,热稳定性越高。每个样品测定重复三次,以平均值作为实验结果。

2 结果与分析

2.1 牦牛乳酪蛋白修饰程度分析

根据图1所示,牦牛乳酪蛋白酶法交联程度为20.77%±0.82%,由于位阻效应等因素,酶法交联程度相对较低。琥珀酸酐用量为0.1、0.2、0.6g时,酪蛋白的酰化程度分别为73.33%±0.32%、85.77%±0.43%、90.00%±0.24%,乙酸酐酰化程度为87.91%±0.32%、琥珀酸酰化程度为18.52%±0.43%,由此可见,不同酰化试剂对牦牛乳酪蛋白的酰化程度具有差异。琥珀酸酐、乙酸酐与氨基反应活性较高,酰化程度高。琥珀酸酐带有负电荷,与氨基反应后在蛋白质侧链上引入了负电基团,使得蛋白质内部侧链间及蛋白质分子之间静电斥力增大,加之琥珀酸体积较乙酸大,酰化后酪蛋白结构变得更加伸展,从而使内部包埋的氨基裸露,酰化程度最高[2,12-13]。琥珀酸反应活性较低。

图1 TG修饰与不同酰化条件下酪蛋白的修饰程度图Fig.1 Modification degree of yak caseins under different acylation and TG cross-link

2.2 交联修饰对酪蛋白热稳定性的影响

从图2可以看出,在相同温度下,交联后的酪蛋白热稳定性显著提高。牦牛乳酪蛋白与交联酪蛋白热稳定性均随着热处理温度的升高而降低。

图2 TG交联对酪蛋白热稳定性的影响Fig.2 Effect of TG cross-linking on the heat stability of yak caseins注:图例中数字为酪蛋白酰化程度,图3同。

热处理过程中,酪蛋白分子热运动加剧,分子之间易于聚集而沉淀,酪蛋白分子热运动随着加热温度的升高而加剧,上清液中游离酪蛋白分子减少,沉淀量增加。由于TG交联时蛋白质分子内部和分子间形成共价键,增强了酪蛋白分子内部的作用力,从而使酪蛋白分子结构不易随着体系环境变化而改变,分子间不易形成相互作用力而聚集,因此稳定性得到了提高[14-16]。许多研究表明,TG能提高乳的热稳定性。O’Sullivan M M报道脱脂乳经TG处理后,在pH6.3～7.1范围内比未处理乳的热稳定性更高[14]。本实验与他们的研究报道是一致的。

2.3 不同程度琥珀酰化修饰对牦牛乳酪蛋白热稳定性的影响

从图3可以看出,随着温度的升高,牦牛乳酪蛋白及不同酰化程度酪蛋白热稳定性逐渐降低；同一温度下,随着酰化程度的增加,牦牛乳酪蛋白热稳定性逐渐升高。

图3 琥珀酰化修饰对牦牛乳酪蛋白热稳定性的影响Fig.3 Effect of succinylation on the heat stability of yak caseins

琥珀酰化修饰使酪蛋白游离氨基连接了琥珀酰基,净负电荷增加,结构伸展,疏水性相互作用降低,酪蛋白分子间静电斥力增加,在加热过程中不易聚集而沉淀,因此上清液中溶液的游离酪蛋白分子增加,热稳定性增加[17-18]。

2.4 不同酰化试剂对酪蛋白热稳定性的影响

从图4可以看出,乙酸酐、琥珀酸和琥珀酸酐修饰后酪蛋白热稳定性增强。不同酰化试剂修饰后酪蛋白热稳定性随着热处理温度的升高而降低。

图4 不同酰化试剂对酪蛋白热稳定性的影响Fig.4 Effect of acylation with different reagents on the heat stability of yak caseins

乙酸酐修饰后,酪蛋白侧链游离氨基连接了乙酰基,由于乙酰基不带电荷,而琥珀酰基带有负电荷,因而乙酰化酪蛋白分子间斥力小于琥珀酰化酪蛋白分子,所以乙酰化酪蛋白热稳定性低于琥珀酰化酪蛋白。由于琥珀酸修饰程度较低,其修饰后酪蛋白热稳定性低于琥珀酸酐修饰酪蛋白。

3 结论

牦牛乳酪蛋白是青藏高原地区的特色资源,利用蛋白质结构修饰是改善蛋白质功能性质的主要手段。牦牛乳酪蛋白经过酶法交联和化学酰化修饰后热稳定性发生变化,具体表现为:牦牛乳酪蛋白与修饰酪蛋白热稳定性随着温度的升高而降低；TG交联修饰后,牦牛乳酪蛋白热稳定性增强。采用不同酰化试剂修饰后,牦牛乳酪蛋白热稳定性增强；其中,当酰化试剂摩尔用量相同时,琥珀酸酐修饰酪蛋白热稳定性最强,其次为乙酸酐修饰酪蛋白,再次为琥珀酸修饰酪蛋白。琥珀酸酐修饰后,牦牛乳酪蛋白热稳定性随着酰化程度的升高而增强。结果可为牦牛乳酪蛋白修饰和产品开发及利用提供参考依据。

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Heat stability of yak caseins with acylation
and TG cross-link modification

YANG Ji-tao1，YANG Min1,2，*，ZHANG Yuan1，YANG Xi1

(1.College of Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Functional Dairy Product Engineering Laboratory of Gansu,Lanzhou 730070,China)

Casein in yak milk was modified by acylating reagents and transglutaminase(TG),and modified casein was analyzed for their heat stability. Spectrophotometry at 280nm was uesd to determine the size of the casein heat stability. The results showed that the heat stability of casein greatly increased after modification of transglutaminase(TG)cross-linking. After using different acylating reagents modification,the heat stability of casein increased. Different modified casein heat stability showed a great difference,succinic anhydride modified casein had the strongest heat stability. The results could provide a reference basis for yak casein modification and product development.

yak casein;heat stability;acylation;cross-linking;transglutaminase

2014-07-22

杨继涛(1981-)，男，硕士，讲师，研究方向：食品科学。

*通讯作者:杨敏(1981-)，女，博士，副教授，研究方向:乳品科学与技术。

TS252.42

A

:1002-0306(2015)09-0129-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.019