湘杂油631油菜种子黄、黑粒的耐贮性差异

李 亮，米泽洲，张 祥，李晓明，田向荣

(1.吉首大学植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南 吉首 416000；2.湘西土家族苗族自治州农业科学研究院，湖南 吉首 416000；3.吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000)



湘杂油631油菜种子黄、黑粒的耐贮性差异

李 亮1，2，米泽洲1，3，张 祥1，3，李晓明2，田向荣1

(1.吉首大学植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南 吉首 416000；2.湘西土家族苗族自治州农业科学研究院，湖南 吉首 416000；3.吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000)

油菜；种子；黄黑粒；耐贮性；差异

在相同遗传背景下，不管是甘蓝型还是芥菜型油菜，黄籽油菜与黑籽油菜相比，具有皮壳率低、含油量高、蛋白质含量高等特点，受到油菜育种专家的普遍重视[1].实际上，油菜种子颜色不只是一个外观问题，还是关系到收获产品品质的重要问题，也是关系到作物生存繁衍的生态和进化问题.以往对油菜种子颜色的研究主要针对形成黄、黑色籽粒的物质基础[1-3].人们虽然对油菜种皮中各类物质含量的测定有了一定的研究成果，但未见将油菜黄籽与黑籽所含物质的差别与其耐贮藏性联系起来进行研究，也几乎没有对黄、黑粒种子在萌发和贮藏行为中的差别进行研究.

1 材料与方法

1.1 供试材料

湘杂油631油菜种子由湖南省春云农业科技股份有限公司提供，按颜色的深浅分为黄色和黑色2种，用1 g/L的NaClO溶液表面消毒2～3 min，去离子水冲洗后吸去表面水分，按照文献[5]的方法，将种子置于40 ℃和相对湿度为100%的培养箱中进行人工老化.

1.2 种子萌发率的测定

按照文献[6]的方法，分别取老化0，3，6，9 d的黄、黑色油菜种子，置于垫有2层滤纸的培养皿中，加入适量蒸馏水.每个取样50粒，在20 ℃、光照为0 级的培养箱中培养7 d，测其发芽率(发芽率=油菜种子发芽的数目/50 ×100%)，重复3次.

参照文献[7]的方法，本实验用羟胺氧化法测定超氧阴离子自由基的产生速率，用单位时间内NaNO2的增加值表示超氧阴离子自由基的产生速率.具体操作过程如下：称取经不同方法处理后的材料0.2 g，加入50 mmol/L的磷酸缓冲液3 mL,冰浴研磨5 min，然后迅速转入预冷的离心管中，在12 000g,4 ℃条件下离心25 min，得到上清液(即实验所需的超氧阴离子自由基提取液).取经不同方法处理的实验组提取液各1 mL，分别按照标准溶液的反应过程依次加入反应试剂至反应完全.取反应液中粉红色水相用分光光度计测定溶液在530 nm下的吸光值(每组共测定5次吸光值，每次间隔30 s).最后用材料每克干重每分钟变化的微摩尔数作为超氧阴离子自由基的实际反应速率.

1.4 过氧化氢(H2O2)含量的测定

参照文献[8-9]的方法，利用Ti4+与H2O2形成有色络合离子的特性测定其含量.称取经不同方法处理后的材料0.2 g,用50 g/L的三氯乙酸(TCA)3 mL冰浴研磨5 min，然后在4 000 r/min转速下离心20 min，得样品提取液.分别取样品提取液各1 mL，依次加入反应液0.1 mL 50 g/L的硫酸钛0.2 mL的浓氨水，待沉淀形成后，在4 000 r/min转速下离心10 min，弃去上清液，保留沉淀并加入浓度为2 mol/L的H2SO45.0 mL，使沉淀充分溶解，并在410 nm波长下比色测定各组的吸光值.结合标准曲线以每克干重材料中所含的H2O2的微摩尔数作为过氧化氢含量的定量指标.

1.5 抗氧化酶活性的测定

参照文献[10-11]的方法进行抗氧化酶的初步提取.称取经不同方法处理后的材料0.2 g，加入50 mmol/L的磷酸缓冲液3 mL,冰浴研磨5 min，然后迅速转入预冷的离心管中，在10 000g,4 ℃条件下离心15 min，得上清液(即SOD和CAT活性测定所需粗酶提取液).

1.5.2 过氧化氢酶(CAT)活性测定 参照文献[13]的方法，用H2O2溶液的紫外吸收变化来表示CAT的活性.测定时，在3 mL反应液 (含50 mmol/L 磷酸缓冲液，pH值7.0)中加入100 μL 10 mmol/L的H2O2迅速混匀，在240 nm下记录光吸光值的变化，30 s读数1次，连续读数5次,最后以每毫克蛋白每分钟光度值变化作为CAT活性.

1.6 抗坏血酸(AsA)含量的测定

参照文献[14]的方法，称取植物材料0.2 g，加入提取液(60 g/L)TCA，含0.1 mmol/L的EDTA)3 mL,冰浴研磨5 min，然后迅速转入预冷的离心管中，在12 000g,4 ℃条件下离心20 min，得上清液(即实验所需AsA粗提取液).利用Fe3+对抗坏血酸的氧化作用，用双吡啶定量的Fe2+浓度(单位：μmol/L)来表示AsA的含量.

1.7 丙二醛(MDA)含量的测定

参照文献[15]的方法，称取植物材料0.2 g，加入提取液(100 g/L的TCA)3 mL,冰浴研磨5 min，然后迅速转入预冷的离心管中，在8 000g,4 ℃条件下离心15 min，得上清液(即实验所需丙二醛粗提取液).

取上清液1 mL于试管中，加入3 mL 5 g/L的TBA溶液，混合均匀，盖上试管塞,沸水浴25 min,迅速冷却至室温.8 000g离心15 min，用1 mL 100 g/L TCA+3 mL 5 g/L TBA溶液混合均匀作对照，分别测定粗提取液在532 nm和450 nm下的吸光值.

2 结果与讨论

2.1 萌发率变化

图1 老化处理时间对油菜种子发芽率的影响

不同的老化处理时间下油菜种子的发芽率变化如图1所示.从图1可知，人工老化对黄、黑粒油菜种子的萌发率影响十分明显，随着老化程度的加深，黄、黑粒油菜种子的萌发率均在明显下降.其中，人工老化5 d是一个重要拐点，在此之前湘杂油631种子萌发率损失较为缓慢，而之后则丧失十分迅速.从黄、黑粒种子对老化响应曲线可知，黄粒种子萌发率更容易丧失.人工老化过程中，黄籽的老化比黑籽萌发率损失速度更快，老化9 d时，黄籽已经彻底丧失了萌发能力，而黑籽萌发率仍有约21.33%.

老化3 d及未老化处理的黄、黑粒湘杂油631种子超氧阴离子自由基产生速率如图2所示.从图2可知，经过3 d的人工老化处理后，老化过的黄、黑籽超氧阴离子产生速率要比相应的未老化处理的黄、黑籽的稍高，老化黄籽比未老化黄籽高0.006 μmol·min-1·g-1DW，老化黑籽比未老化黑籽高0.008 μmol·min-1·g-1DW，但差别均不明显.从黄、黑粒种子的比较来看，不管是老化处理过的还是未老化处理过的种子，黄籽的超氧阴离子产生速率要比黑籽的大很多，老化3 d处理过的黄籽要比黑籽高0.23 μmol·min-1·g-1DW，未老化处理的黄籽要比黑籽高0.24 μmol·min-1·g-1DW.

2.3 过氧化氢(H2O2)含量比较

图2 老化3 d及未老化处理的黄、黑粒湘杂油631

图3 老化3 d及未老化处理的黄、黑粒湘杂油631

老化3 d及未老化处理的黄、黑粒湘杂油631种子的过氧化氢(H2O2)含量如图3所示.从图3可知，人工老化3 d的H2O2含量的提升非常明显，老化3 d的黄、黑籽相对于未老化处理的黄、黑籽中H2O2含量都偏高，分别提升了约1倍和1.8倍.从黄、黑籽的比较来看，无论老化处理过的还是未老化处理过的，黄籽中H2O2含量要比黑籽高，老化3 d处理的黄籽比黑籽高0.002 9 μmol·g-1DW，未老化处理的黄籽要比黑籽高0.003 4 μmol·g-1DW.2.4 超氧化物歧化酶(SOD)活性比较

老化3 d及未老化处理的黄、黑粒湘杂油631种子的超氧化物歧化酶(SOD)活性如图4所示.从图4可知,人工老化处理提高了黄、黑粒种子的SOD活性，老化3 d处理的黄籽比未老化处理的黄籽SOD活性变化高约30%，老化3 d处理的黑籽比未老化处理的黑籽SOD活性变化高约26%，这说明二者在老化过程中SOD活性提升差距不大.从黄、黑籽的比较来看，无论是老化处理过的还是未老化处理过的，黑籽SOD活性要比黄籽SOD活性高，老化3 d处理的黑籽比黄籽高79.12 unit·mg-1protein，未老化处理的黑籽要比黄籽高74.57 unit·mg-1protein.

2.5 过氧化氢酶(CAT)活性比较

图4 老化3 d及未老化处理的黄、黑粒湘杂油

图5 老化3 d及未老化处理的黄、黑粒湘杂油

老化3 d及未老化处理的黄、黑粒湘杂油631种子的CAT活性如图5所示.从图5可知，老化3 d处理的黄籽比未老化处理的黄籽CAT活性高0.007 μmol H2O2·min-1·mg-1protein，老化3 d处理的黑籽比未老化处理的黑籽CAT活性高0.052 μmol H2O2·min-1·mg-1protein.与前几个参数不同的是，老化3 d处理过的黄籽CAT活性要比黑籽CAT活性高，但未老化处理过的黑籽CAT活性要比黄籽CAT活性高，老化3 d处理的黄籽CAT活性比黑籽CAT活性高0.011 μmol H2O2·min-1·mg-1protein，未老化处理的黑籽CAT活性要比黄籽CAT活性高0.007 2 μmol H2O2·min-1·mg-1protein.

2.6 人工老化过程中黄、黑粒湘杂油631种子抗坏血酸(ASA)含量比较

老化3 d及未老化处理的黄、黑粒湘杂油631种子的抗坏血酸(ASA)含量如图6所示.从图6可知，经过老3 d处理的黄、黑籽ASA含量都要比未老化处理的黄、黑籽的低.老化3 d处理的黄籽比未老化处理的黄籽ASA含量低0.39 μmol AsA·g-1DW，老化3 d处理的黑籽比未老化处理的黑籽ASA含量低0.27 μmol AsA·g-1DW.但不管是老化处理过的还是未老化处理过的，黑籽的ASA含量都要比黄籽的高.老化3 d处理的黑籽ASA含量比黄籽的高0.26 μmol AsA·g-1DW，未老化处理的黑籽ASA含量要比黄籽的高0.15 μmol AsA·g-1DW.

2.7 人工老化过程中黄黑粒湘杂油631种子丙二醛(MDA)含量比较

老化3 d及未老化处理的黄、黑粒湘杂油631种子的丙二醛(MDA)含量如图7所示.从图7可知，经过老化3 d处理的黄、黑籽MDA含量都要比未老化处理的黄、黑籽的高，但不是很明显.老化3 d处理的黄籽比未老化处理的黄籽MDA含量高0.403 nmol·g-1DW，老化3 d处理的黑籽比未老化处理的黑籽MDA含量高0.399 nmol·g-1DW.但不管是老化处理过的还是未老化处理过的，黑籽的MDA含量都要比黄籽的稍高.老化3 d处理的黑籽MDA含量比黄籽高0.062 μmol·g-1DW，未老化处理的黑籽MDA含量要比黄籽的高0.066 μmol·g-1DW.

图6 老化3 d及未老化处理的黄、黑粒湘杂油631

图7 老化3 d及未老化处理的黄、黑粒湘杂油631

3 结论与分析

人工老化对湘杂油631黄、黑粒种子的萌发率有明显的降低作用，且人工老化5 d为萌发率丧失的重要拐点.就黄、黑粒的比较而言，人工老化5 d以前二者的萌发率丧失虽有区别，但变化的差距不是十分明显；而在人工老化5 d以后，黄粒种子的萌发率降低明显快于黑粒种子.这些结果说明湘杂油631的黑粒种子比黄粒种子的耐贮性强.

(1)结合氧化衰老学说，黑粒种子具有更强的耐贮性的物质基础可能与氧代谢和抗氧化系统有关.黄、黑粒种子超氧阴离子自由基在老化过程中的差异不大，而H2O2的含量则差距明显，说明黄、黑粒种子活力丧失与H2O2积累及其所带来的活性氧损伤有关.尽管在脂质过氧化终产物MDA含量上，老化状态下黄、黑粒湘杂油631种子的差距并不大.但从抗氧化酶系统活性和抗氧化抗坏血酸含量的差距上，可以认为较弱抗氧化能力是黄粒种子萌发率丧失快的直接原因.同时，从抗氧化酶系统活力与非酶抗氧化物质的比较上可以认为，非酶抗氧化物质含量的差距可能是黄、黑粒种子萌发率丧失差距的主要物质基础.

(2)对油菜种子颜色差异的物质基础研究上，比较统一地指向了2类物质：一类是多酚，曾盔等[2，16]对芥菜型油菜种皮物质化学成分进行分析，指出多酚物质的差别是黄、黑粒种皮颜色差距的物质基础，观察到黑皮样品对香草醛变红色而黄色种皮没有变色，这表明黄、黑粒种子的多酚在总量上虽差距不大，但在分子结构存在差异；另一类是黄酮，在刘显军等[3]的油菜种皮的分子基础研究中，香草醛染色表明，在发育中的芥菜型油菜黑籽种皮中含有黄烷3,4-二羟基醇和黄烷4-羟基醇，而黄籽没有这种物质.就抗氧化而言，这2类物质都是非酶抗氧化物质的重要组成部分，笔者对氧代谢变化和抗坏血酸含量的差异上得到了更明显的验证，很可能多酚的活性结构和黄烷醇的新成分赋予了黑粒种子更强的抗氧化能力，从而可以维持较高的通用还原力(如抗坏血酸)水平.

(3)湘杂油631黑粒种子的耐贮性强于黄粒种子，其背后的关键机制是黑粒种子中所含非酶抗氧化物质强于黄粒种子.所以，黄粒油菜种子的选育固然有利于后期加工，但在种子生产和活力保持的环节上则要作更为充分的考虑.

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(责任编辑 陈炳权)

Storability Differences Between Yellow and Black Seeds of Xiangzayou 631

LI Liang1，2，MI Zezhou1，3，ZHANG Xiang1，3，LI Xiaoming2,TIAN Xiangrong1

(1.Key University Laboratory of Plant Resources Conservation and Utilization (Hunan Province)，Jishou University,Jishou 416000，Hunan China;2.Institute of Agricultural Science，Xiangxi Autonomous Prefecture of Tujia and Miao Minorities，Jishou 416000,Hunan China;3.College of Biology and Environmental Science，Jishou University，Jishou 416000,Hunan China)

To investigate the relationship between seed color and storability，the artificial aged Xiangzayou 631 seeds have been used as materials to study the germination and antioxidative physiological and biochemical variation.Results showed that the germination rate of both yellow and black rape seeds decreased significantly after accelerated artificial aging，and germination of yellow seeds decreased dramatically faster than the black. Superoxide radicle production，contents of hydrogen peroxide and MDA increased by 3d accelerated artificial aging treatment，activities of antioxidative enzyme (SOD and CAT) increased obviously，and the content of AsA declined obviously.The comparison between two color seeds showed superoxide radicle production，hydrogen peroxide contents of the yellow seeds were much higher than those of the black seeds，but the SOD activity and AsA content of yellow seeds were much lower than those of the black seeds.It can be concluded that the black seeds of Xiangzayou 631 possess stronger storability due to greater contents of nonenzymatic antioxidants.

Xiangzayou 631;yellow and black;seeds;storability;difference

1007-2985(2015)04-0048-06

李 亮(1970—)，男，湖南常德人，湘西土家族苗族自治州农业科学研究院农艺师，主要从事种子评价与推广研究.

Q945；S351.1

A

10.3969/j.issn.1007-2985.2015.04.013