金属硫蛋白的检测方法研究进展

刘璐，刘慧萍，陈伶利，刘俐，向琴，李玲，朱应武

(湖南中医药大学 中医学院，湖南 长沙 410208)

金属硫蛋白(MTs)，是广泛存在于生物体中，具有低分子质量(1 ～10 kD)、富含半胱氨酸(20% ～30%)、缺乏芳香族氨基酸的一类金属结合蛋白质［1-4］。1957 年，Margoshoes 等［5］首次报道从马肾中分离得到Cd-MT，此后，MTs 便成为基础和应用科学研究的热点之一，研究内容涉及生物体微量元素的储存、运输和代谢，重金属的解毒、清除自由基和参与应激反应等生物学功能的关系还有与疾病的关系等各方面。近年来，人们对其进行了广泛而深入的研究，生物化学领域国际权威丛书都已开辟了金属硫蛋白这一专栏。目前，MTs 在生物学领域、医学保健领域、转基因工程领域、环境检测标志物和疾病防治等应用的研究显示了诱人的前景。因此，尽快寻找一种能准确、快速的检测金属硫蛋白的方法，从而更加深入的对其进行研究，使其能够发挥更大的作用显得十分必要。迄今为止许多研究者先后应用和发展了关于检测MTs 的技术，主要有金属结合法、电化学分析法、蛋白质分析法、色谱、光谱分析法等。本文重点阐述目前对MTs 检测方法的研究进展。

1 金属结合法

金属结合法是利用MTs 对金属具有高亲合力的特点，通过其对不同金属亲合力的差异性以及其热稳定性而建立的检测方法。要计算MTs 的含量，关键是通过测定与MTs 结合的金属及竞争性替换金属的含量来检测MTs。

1973 年，Piotrowski 等［6］基于Hg2+在酸性环境下与MTs 结合的原理，首先创建了测定组织中MTs的金属结合法。该法迅速而简便，但存在一些缺点，如在酸性环境下可与MTs 结合，并且还可将其他金属离子置换出来。同时此法对于203Hg 加入的用量极为苛刻，加入量过小将导致测定的结果偏低;加入量过大将可能会出现测定结果偏高。所以操作起来难以掌握，鉴于此，有专家利用层析技术改良原来方法后可检测出100 μL 中100 nmol 的MTs。紧接着相继出现Cd/血红蛋白亲和分析法、银血红蛋白饱和法和银染法等。

Cd/血红蛋白亲和分析法［7］是一种快速、灵敏、特异的评估生物样本中MTs 含量的方法，本方法的优点是能够评估大多数生物组织中MTs 含量，具有快速、周期短、灵敏、消耗少、适于大量研究，缺点是还存有潜在误差，无法用于血浆或全血MTs 检测。1995 年戴建国等用镉饱和法测定小白鼠肝中金属硫蛋白，该法通过口给以锌盐诱导小鼠金属硫蛋白合成，利用镉饱和法进行研究，该方法有较好的重现性。林芃等［8］于2001 年用血红蛋白/镉饱和法测定鱼组织中的MTs，此法测定鱼组织中的MTs 浓度具有快速、灵敏、耗时少、有利于大量研究等特点。本方法能检测40 ng MTs(组织浓度0.18 μg MTs/g)，重复分析的RSD ＜均值的4%。2012 年黄伟等用血红蛋白/镉饱和法测定大鼠肝和血中MTs。

银血红蛋白饱和法［9］主要基于Ag+与MTs 巯基团高度亲和性的特征测定组织中MTs。银饱和法可以检测出的MTs 来源范围很广。而且，体外研究证明1 mol 金属硫蛋白能结合17 g 原子Ag，却只能结合7 g 原子Cd。所以，Ag 饱和法可能比Cd 饱和法有更高灵敏性，也可以认为银饱和法测定MTs 要优于Cd 饱和法。所以当测量低浓度MTs 时，Ag 饱和法为优先选择。张保林等［10］基于Ag+与MTs 的高亲合力，及MTs 具有热稳定性的特点通过原子吸收光谱(AAS)测定了兔肝Zn-MT。该方法测定MTs浓度不需要去除样品中共存的其它蛋白质，操作方便、重复性和准确性好且不需特殊的仪器设备。检测下限为1 μg/mL。

Fuminor 等［11］用SDS-PAGE 后银染确定MTs 的方法来检测镉中毒小鼠的肝脏和其它来自体外培养细胞的提取物中MTs。本方法通过优化条件，使最低检测限为ng/lane。

金属结合法是通过检测金属的含量从而间接的推算得到MTs 的含量，因此其特异性不如直接检测的高。如:Hg 饱和法中Hg+不仅能与MTs 相结合也会结合其它一些小分子量化合物;Cd 置换不出已与MTs 结合的Ag 或Cu 等。

2 电化学法

电化学方法是通过测定巯基(—SH)然后计算出MTs 的浓度。巯基的测定是利用其在汞滴电极表面产生氧化还原反应出现的电位变化来实现。

因为金属结合法具有特异性较差的缺点，因此在1979 年Olafson 等［12］建立了不受分子中金属含量影响的方法，此法使用示差脉冲极谱法测定MTs其检出下限是10－8mol/L。该法的优点是能够特异地反映出MTs 的量而不是金属的量，但缺陷是容易受样品中具有还原性物质的干扰。

Bordin 等能快捷地分析出还原型的MTs 并利用示差脉冲极谱法可以非常方便地检测出样品中多种形式的MTs，本方法通过改变检测体系中的pH值而达到目的。

Bebianno［13］于1992 年 检 测 了 贻 贝 组 织 中 的MTs 的含量，应用差分微分脉冲极谱法测定。铁峰等［14］应用线扫极谱法快速测定鱼组织中的金属硫蛋白。此法分离方法比传统方法简单省时，适合实验室规模分离纯化。褚德莹等利用线伏安法通过测定生物组织中金属硫蛋白的巯基在钴氨溶液中的催化氢波测定金属硫蛋白的含量。2001 年，李明春等［15］在酵母菌类金属硫蛋白的分离纯化及性质鉴定中采用组织化学的方法，使用DTNB 检测巯基浓度。2003 年，Hourch 等在采用双波阴极溶出伏铵法测定了MTs 其检测下限为6 ×10－12mol/L。本方法灵敏度高，用于组织和体液中MTs 的测定。2006年，Nunez 等采用示差脉冲极谱法对水生物体中MTs 的测定。检测范围为0 ～25 mg/g dw。2008年，Almroth 等采用示差脉冲极谱法测定MTs，其检测范围为1 ～10 mg/g pr。

3 蛋白质分析法(免疫法)

蛋白质分析法(免疫法)通过蛋白质含量测定来计算MTs 浓度，免疫法具有灵敏(灵敏度在pg/mL级)、特异等特点，因此适用于微量检测。近年来建立了放射免疫分析法(RIA)、竞争性酶联免疫吸附分析法(CELISA)和酶联免疫吸附分析法(ELISA)等用于MTs 的检测。

1979 年，Mallie 等最先建立检测了大鼠血清中的MTs 浓度的方法是利用RIA 技术，此方法检测范围为0.1 ～100 ng/mL。1990 年，Mulder 等建立应用RIA 技术检测人体液MTs 浓度的方法，本方法因抗体来源和特性不同将导致结果不同，具有高度特异性。但本方法使用了放射性同位素，具有放射性污染且需要使用昂贵的专用仪器测量。1986 年，Thomas 等首先建立了快速、不需要接触放射性同位素且灵敏度可达100 pg/mL 的酶联免疫吸附分析法测定MTs 含量，此法结果与放射免疫分析法相似，但比放射免疫分析法相对迅速、成本低和安全。

1995 年，Akintola 等［16］通过酶联免疫吸附分析法测定人血浆和尿液中MTs 浓度，此方法的灵敏度为5.0 ng/mL。Van 等［17］建立的ELISA 可检测出60 pg 的人胎肝的MTs，并且发现抗体的特异性与MTs 所含的金属离子种类有关系。还有学者［18］建立ELISA 来检测不同亚型的MTs 是通过合成某一段特异的肽链，或者免疫动物制备表位特异性抗体。Margarita 等［19］开发出以辣根过氧化物酶(HRPO)标记的MTs 作为共轭物和兔IgG 的高滴度多克隆抗体检测人血清中MTs 含量的一种新的灵敏的竞争性ELISA 系统。该系统可以有效测定MTs 的范围为10 ～2 000 000 pg/mL，检测下限(0.5 pg/well)因此，此方法不仅能够用于检测生物材料中MTs 的浓度，而且还能够研究MTs 含量的微小偏差。1999年，郑军恒等［20］建立了两种酶联免疫吸附分析法，并成功运用于血液MTs 浓度的测定。直接型酶联免疫吸附分析法(检测范围1 ～10 ng)和竞争型酶联免疫吸附分析法(检测范围50 ～500 ng)可分别运用于较纯的样品和较粗的样品中MTs 的浓度的检测。张亨山等［21］于1997 年建立利用单克隆抗体为二种能识别不同抗原决定簇的兔肝MT2的双抗体夹心酶联免疫吸附分析法。本方法有较好的灵敏性(灵敏度为20. 0 ng/mL)和可靠性。且运用于人MTs 浓度的检测。黄波等［22］于2000 年利用生物素-亲和素系统建立的竞争型酶联免疫吸附分析法，其系统提高了方法的灵敏度(检测下限:2.5 ng/mL)并可用于检测人体尿液中MTs 的含量。此方法操作内和操作间的变异系数分别为2.25%和1.19%，回收率为97.6% ～100.0%，说明此方法具有较好的精密度和准确度。2009 年，Meistertzheim 等建立了ELISA 方法测定牡蛎中MTs 含量，检测范围为0. 01 ～0. 5 mg/g。2010 年，贾连群等［23］改进了竞争型ELISA 检测人尿MTs 含量的方法，通过分离纯化成人肝脏金属硫蛋白来制备抗金属硫蛋白单克隆抗体。在应用中此方法有较好的精确度和准确度。

免疫检测方法的不足之处为:其中有些方法存在交叉反应、需要接触放射性同位素，操作不方便，还有学者［24］认为MTs 具有大量的二硫键，其特性容易被氧化，使其免疫性被改变，进而将影响蛋白质分析法的测定结果。

4 色谱、光谱分析法

Hunziker 等［25］利用原子吸收光谱法来测定样品的金属含量，从而检测出MTs 的浓度。该法使用RPHPLC 从兔组织样品中分离出的7 种亚型作为样品。Suzuki 等可在1 h 内检测出浓度＜1 μg/mL 的1 mL 上柱样品中的MTs 含量，并可以测定不同型的MTs。本方法可以避免常规色谱层析法的分辨力差并且洗脱费时的缺陷。Jin 等［26］利用高效液相色谱法分离MTs，该法的灵敏度＜1 μg/mL，本方法直接对MTs 的定量检测是基于样品对紫外吸收的特性。2008 年，Jebali 等［27］通过Cu、Cd 和Hg 诱导肝脏中的MTs，利用RP-HPLC-FD 测定。该方法比用分光光度计检测灵敏度高，特异性好。2013 年，薛金花等［2］通过左氧氟沙星-钯作为荧光探针利用共振散射法检测MTs 浓度并成功应用于人尿液中的检测。2012 年，刘璐等［1，28］通过环丙沙星-铜配合物利用紫外分光光度法检测MTs 浓度。第二年，他们团队利用其配合物使用荧光分光光度法、共振散射法分别测定人尿液中MTs 浓度，并比较两种方法。2014 年钱秋梅等［3］基于8-羟基喹啉-5-磺酸(HQS)-镉配合物通过荧光猝灭法检测尿液中MTs 浓度。检出限为9.36 ×10－9mol/L。

以上所述的各种方法均具备各自的优缺点，对于组织器官中的MTs 的含量、体液中的MTs 含量(正常人血清和尿的MTs 含量一般不超过2 ng/mL和10 ng/mL)或MTs 含量较低的样品、MTs 含量相对较高的样品及MTs 的同分异构体则分别可利用HPLC-AAS 法和血红蛋白饱和法、RIA 和ELISA 等免疫法、金属结合法以及HPLC 法进行检测。当然，检测方法的测定结果还可能会受到如样品处理方法、MTs 结合金属的种类以及自身具有的广泛性特点和生物作用多样性特点等［29-30］因素的影响。总之，对于它的定量的方法仍然是多种多样，并且这些方法还都存在着一定的缺陷，目前为止依然没有找到一种定量检测MTs 的统一标准方法［31］。近年来，随着MTs 的深入研究发现其具有很大的开发潜力和无法估量的价值。将MTs 产业化成为必然，可目前却存在相当大的问题，因为尚未发现一种简便快捷、灵敏高且适用于产业化的综合监测技术。因此，当前急需建立检测MTs 的统一标准，而解决此问题也将会成为研究MTs 的重点攻关问题。

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