小鼠心肌微血管内皮细胞的原代培养及鉴定＊

任丽蓉 何蔺 刘涛 王浩宇

（1.四川医科大学附属医院心内科，四川 泸州 646000；2.川北医学院第二临床医学院·南充市中心医院心内科，四川 南充 637000）

微血管内皮细胞不仅构成了血液与组织间的重要屏障，参与物质交换，同时微血管内皮细胞还具有合成、分泌和降解生物活性物质的功能［1］。在对内皮细胞的不断研究中，发现微血管内皮细胞的功能损害是糖尿病［2］、感染［3］、纤维化［4］、休克及肿瘤等多种疾病的病理基础［5］。微血管内皮细胞的功能不同于大血管内皮细胞［6］，因此在对内皮细胞的研究中必须区分二者的差异。另外，不同的组织器官微血管内皮细胞的功能具有特异性。目前国内外已有相当的文献报道了不同组织器官的微血管内皮细胞的分离培养方法，但是小鼠心肌微血管内皮细胞（mouse cardiac microvascular endothelial cells，MCMECs）的分离培养方法仍不成熟。本实验介绍一种可以避免胶原酶等消化酶的化学损伤，同时又简单可行、重复性好且经济节约的小鼠心肌微血管内皮细胞培养方法，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 3～4周大小的SPF 级雄性C 57小鼠，购自成都达硕生物科技有限公司。

1.2 主要试剂 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Gibco公司，明胶（gelatin）购自Sigma公司，内皮细胞专用培养基（endothelial cell medium，ECM）购自Sciencell公司，0.25%胰蛋白酶溶液、低糖／DMEM 培养基和青霉素／链霉素混合液购自Hyclone公司，兔抗小鼠vWF 相关抗原多克隆抗体（Ⅰ抗）购自Santa Cruz，Matrigel胶购自BD 公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠心肌微血管内皮细胞的原代培养 MCMECs的分离参照相关文献［7，8］并改进。将5～8只C 57小鼠脱颈法处死，全身于75%酒精溶液中浸泡3～5min后，无菌条件下逐层打开胸腔，迅速取出心脏并置于含有1%青／链霉素混合液和适量肝素钠的低糖／DMEM 培养基中清洗干净。将清洗干净的小鼠心脏转移至冰袋上盛有低糖／DMEM 培养基的培养皿中，小心去除左右心房、瓣膜组织和结缔组织，将余下的心室组织用70%［9］的酒精浸泡15s，以灭活心肌内外膜细胞。PBS 溶液彻底清洗心室组织，吸弃多余的PBS溶液后滴加少量FBS至余下的心肌组织中，然后用眼科剪快速地将其剪切为1mm×1mm×1mm 大小的组织块。将剪碎的组织块均匀地接种至1%明胶包被的6孔板中，将6孔板放入37℃5% CO2的培养箱中孵育60min 使组织块牢固贴壁后，轻轻追加2mlECM（含5%FBS＋1% 内皮细胞生长添加物ECGS＋1%青霉素／链酶素混合液）完全培养基继续培养。约24小时后可见组织块周围有细胞爬出，48小时后第1次换液，约65小时后去除组织块继续培养贴壁细胞。以后每2天换液1次，大约1周后细胞汇合呈单层。

1.3.2 小鼠心肌微血管内皮细胞的传代培养 原代MCMECs生长至6孔板底面积的80%～90%时吸弃旧培养基并用PBS溶液清洗6孔板3次后，每孔加入适量37℃预热的0.25%胰蛋白酶液，倒置显微镜下观察，当细胞收缩变圆，细胞间隙增大时立即加入含10%FBS的低糖／DMEM 培养基终止消化。吸管轻轻吹打6孔板底面至细胞全部脱落后，将细胞悬液转移至15ml离心管中，1200r／min 离心3min。去掉离心管内液体，加入适量ECM 完全培养基后轻轻吹打均匀，将重悬的细胞按1∶2比例传代至1%明胶包被的培养皿中，置于37℃5% CO2培养箱中培养24 小时后首次换液，以后每2天换液1次。

1.3.3 小鼠心肌微血管内皮细胞的生长曲线绘制取对数生长期的第二代小鼠心肌微血管内皮细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，按每孔2×104个细胞接种至明胶包被的24孔板中，从第二天开始将每3个孔作为1组进行细胞计数，取平均值，直到将所有组的细胞计数完毕，共8天，以细胞生长天数（d）为横坐标，所得的平均细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线图。

1.3.4 小鼠心肌微血管内皮细胞的鉴定 取第二代或第三代对数期生长的MCMECs细胞，0.25%胰蛋白酶消化制备单细胞悬液，接种至盛有无菌盖玻片的24孔板中。当细胞爬满盖玻片面积的70%～80%时，用PBS溶液清洗3次，每次3min；接着用4%的多聚甲醛固定30min 后用PBS 溶液清洗3 次，每次3min；然后用0.1%的Tritionx－100室温孵育15min，PBS洗3次，每次3min。每张细胞爬片上滴加适量的正常山羊血清室温封闭1小时后，滴加适量兔抗小鼠vWF多克隆抗体（Ⅰ抗，1∶100）至爬片刚好被抗体覆盖，将爬片放入湿盒中4℃过夜，PBS溶液洗3次，每次3min，滴加适量FITC 标记的羊抗兔IgG（Ⅱ抗，1∶100），室温避光孵育1小时后用PBS溶液清洗3次，每次3min，最后用DAPI染核，室温避光孵育15min，同时做空白对照，用PBS代替Ⅰ抗，余步骤相同。用荧光抗淬灭剂封片后在荧光显微镜下观察拍照。

1.3.5 体外小管形成实验 4℃冰箱融化Matrigel胶，48孔板和200μl枪头提前预冷。按每孔100μl将Matrigel胶加至48 孔板内，不要产生气泡，37℃5%CO2培养箱中过夜孵育使胶凝固后，按2×104个细胞每孔加入48孔板内，细胞接种后分别于6、12、24h在倒置显微镜下拍照，动态观察MCMECs的体外小管形成过程。

2 结果

2.1 小鼠心肌微血管内皮细胞的形态学观察 组织块贴壁后24小时开始有少量细胞爬出，成梭形、三角形或多角形（图1A）；培养1周左右可汇合成单层，呈典型的铺路石样（图1B）。传至第三代后在明胶包被的培养皿中细胞仍呈梭形、多角形、铺路石样和管腔样生长（图1C），细胞传至3代内的形态和性状未发生明显变化。

2.2 小鼠心肌微血管内皮细胞的生长曲线 MCMECS的生长曲线近似“S”形，表现为传代后的MCMECs第1、2天生长速度比较缓慢，第3、4天时生长速度增快，进入对数生长期，第5～7天时达到汇合状态，第7、8天细胞数量不再增加，进入停滞期（图2）。说明分离得到的MCMECs的生长具有潜伏期、对数生长期和接触抑制的特性。

2.3 小鼠心肌微血管内皮细胞的免疫荧光鉴定 爬片的细胞经vWF和DAPI免疫化学染色后可见胞浆呈绿色荧光，核呈蓝色荧光（图3），说明分离培养的细胞阳性表达vWF，阳性染色率达90%以上，证明该实验所获细胞为小鼠心肌微血管内皮细胞。

2.4 体外小管形成实验 将MCMECs接种到Matrigel胶后6 小时可观察到细胞已贴壁，并且细胞开始聚集形成不明显的管腔样结构（图4A），12 和24h时细胞已经形成明显的具有三维结构的小管结构，并相互交织成网络状（图4B和C），可见分离得到的微血管内皮细胞具有小管形成能力。

图1 MCMECs的原代培养和传代培养（×100）Figure 1 Primary culture and subculture of MCMECs

图2 MCMECs的生长曲线Figure 2 The growth curve of MCMEC

图3 vWF相关抗原的免疫荧光鉴定（×400）Figure 3 Identification MCMECs by vWF

图4 MCMECs的体外小管形成实验（×100）Figure 4 The tube formation of MCMECs

3 讨论

Nishida等［10］使用胶原酶与胰蛋白酶联合消化法成功分离出大鼠心肌微血管内皮细胞后，国内外多采用该法分离培养心肌微血管内皮细胞。之后，Chen等［11］报道了另一种培养微血管内皮细胞的方法，即组织块贴壁法，该法不仅操作简单，还可以避免消化酶对细胞的化学损伤。后来国内也有使用组织块贴壁法成功培养出大鼠心肌微血管内皮细胞的报道［8，12，13］。而对于小鼠心肌微血管内皮细胞的培养，目前报道的方法主要还是采用酶消化法［14～16］。但由于小鼠心肌微血管内皮细胞的培养难度大，且尚无成熟的细胞系，因此有必要建立一种简单有效的小鼠心肌微血管内皮细胞培养方法。

组织块贴壁法培养细胞成功的关键就是使组织块充分贴壁。本实验方案在剪切心室肌组织时加入了少量的FBS，不仅可以营养心肌组织，避免组织块干燥，且FBS还有促进组织块贴壁的作用；另外，培养细胞的6孔板和培养皿预先用1%的明胶包被也具有促进组织块贴壁的作用。组织块贴壁后最先游离出的细胞是红细胞，接着内皮细胞开始游出，成纤维细胞等杂细胞要72小时后才开始游出［11］。据此本实验在65 小时的时候去除组织块，既可以使心肌微血管内皮细胞充分游出，又避免了成纤维细胞的污染，并且整个培养过程都使用内皮细胞专用培养基培养，该培养基的血清浓度低且含内皮细胞促生长物质，因此该培养基在促进心肌微血管内皮细胞游出和生长的同时，可以抑制成纤维细胞的游出和分裂增殖。由于红细胞基本不贴壁，且无分裂增殖能力，在以后的换液和传代过程中可逐步清除，如此可获得较高纯度的心肌微血管内皮细胞，因为该法操作步骤简单，流程短，还可以减少操作过程中的污染机会。

4 结论

本实验提供了一种操作简便、经济节约且细胞获得量大、活性好、纯度高的小鼠心肌微血管内皮细胞培养方法，小鼠心肌微血管内皮细胞的成功培养将为微血管病变的研究提供了实验所需的细胞来源，并可促进心血管疾病研究的发展。

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