上皮间充质转化与慢性阻塞性肺疾病的气道重塑

吴海兰综述，辛晓峰审校

0 引 言

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是气道壁和肺实质对有害颗粒和气体产生的慢性炎症性的疾病，反复的炎症损伤和组织修复可导致气道管腔的狭窄和肺气肿的形成，从而最终引发持续的、渐进的气流受限，这一过程称为气道重塑。其中，气道上皮细胞是接触香烟烟雾和有害颗粒的首要结构屏障，通过促炎症介质的释放、杯状细胞的增生和黏液分泌的增多等参与了气流受限的形成，更重要的是通过上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)来参与气道的重塑。EMT 是指在胚胎发育、肿瘤转移和组织纤维化过程中发生的上皮细胞脱黏附而转变成具有迁移能力的间质细胞的现象。有研究表明，吸烟可诱导EMT 的发生，且COPD 患者小气道中存在EMT 的现象［1］。EMT 可导致COPD 气道壁的纤维化和管壁的增厚，在COPD 的气道重塑和持续、渐进的气流受限中发挥重要作用。文中就EMT 在COPD 气道重塑中的作用和可能机制作一综述。

1 EMT 的概念

正常上皮细胞呈柱状或鳞状，具有极性，连接紧密，不能移动，位于基膜，覆盖于皮肤或腔道表层。间质细胞是胚胎发育过程中各种结缔组织的共同祖先，没有极性，连接疏松，具有迁移能力，可分化和发育成血管的内皮及平滑肌等其他种类的组织。

EMT 即上皮细胞转化为间质细胞的过程，最早在1982 年由Greenberg 等［2］提出，他们发现上皮细胞在胶原凝胶中会失去极性，形状拉长，并形成伪足，表达出具有活动性的间质细胞的特征。EMT 被证实参与胚胎发育、原肠胚、神经嵴、心脏和其他器官的形成等生理过程［3］。

在EMT 这一过程中，上皮细胞失去细胞间黏着和细胞极性，同时上皮细胞标记物的表达下调，如E-钙黏着糖蛋白(E-cal)和连接素，而间质细胞标记物的表达上调，如波形蛋白、纤维连接蛋白、N-钙黏着糖蛋白、α-平滑肌肌动蛋白等，以及基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases，MMPs)如MMP-2、MMP-3 和MMP-9 等活性增强，细胞获得移动和侵袭的特性，上皮细胞基膜的完整性破坏。上皮细胞向间质细胞的转变是由一系列信号通路和转录因子协同调节的，最后导致上皮标志的丢失和间质特征的获得。

E-cad 可维持上皮细胞的紧密连接，其黏附作用离不开连接素的高表达。在EMT 过程中，以角蛋白为主的细胞骨架转变为以波形蛋白为主的骨架。EMT 的发生可导致细胞间黏附能力的丢失，从而获得迁移力和侵袭力［4］。

2 EMT 的调节

2.1 调节EMT 的细胞因子和转录因子 上皮细胞在一系列调节因子的作用下，丢失细胞间黏附物质，降解细胞膜，同时增加间质细胞的表达物质，获得间质细胞的特性。至今发现已有许多细胞因子和转录因子可诱导EMT 的发生。

细胞因子如转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)、表皮生长因子、纤维母细胞生长因子、肝细胞生长因子等参与了EMT 的调节，而TGF-β 则被认为是所有上皮组织发生EMT 所必不可少的诱导因子。TGF-β 是一种多功能细胞因子，参与调节细胞生长、分化、凋亡、迁移和免疫效应，可介导多种信号通路如Smad 与非Smad 通路等来激发EMT［5］。

EMT 中直接抑制E-cad 的转录因子起源于3 个不同的家族:Snail 家族(包含Snail，Slug 和Smuc)、ZEB 家族(Zeb1/2)和b-HLH 家族(TWIST1/2)。其中ZEB 和b-HLH 均可结合E-box 序列而下调E-cad表达。这些转录因子也可抑制其他连接蛋白包括紧密连接蛋白和细胞桥粒的转录［6］。

2.2 调节EMT 的相关信号通路 TGF-β 在调节EMT 的过程中，首先与受体结合并磷酸化Smad蛋白家族中的Smad2/3，磷酸化后的Smad2/3 与胞浆中的Smad4 形成复合物并发生核转移，与DNA 结合转录因子相配合来调节TGF-β 靶基因的表达。但Smad 转录因子与DNA 的亲和力低，需要与转录辅因子如Snail 和ZEB 因子相互作用来为靶基因获取高的亲和力和选择性［7］。TGF-β 受体、Smad3 和Smad4 均为TGF-β 诱导EMT 所必需，因为抑制这些基因的表达可阻碍TGF-β 诱导EMT 的形成。

此外，TGF-β 也与其它信号通路如Wnt、Hedgehog、Notch、Ras-MAPK 和PI3K/AKT 通路等合作来诱导EMT 的发生。如在PI3K/AKT 通路中，TGF-β、表皮生长因子、纤维母细胞生长因子等细胞因子激活PI3K 而产生信使PIP3，从而使得蛋白激酶活化，继而上调Snail 和β 连环蛋白，降低E-cad 的表达来完成EMT［8］。另有研究证实PI3K/AKT 信号激活后，可通过诱导MMPs 的表达来促进对E-cad 的降解，进而诱发EMT［9］。

McCormack 等［10］提取大鼠肺的正常气道上皮细胞，测定EMT 标志物的表达和骨成型蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信号。结果发现外源性的BMP2、BMP4、BMP7 可诱导气道上皮细胞发生间质类形态改变，提高细胞迁移率，应用BMP 拮抗剂可抑制细胞迁移，证实BMP 信号通路与EMT 有关。

3 EMT 与COPD 的气道重塑

COPD 作为慢性气道炎症性疾病，气道重塑是其主要的病理学特征之一。气道重塑的发生与气道炎症引起的气道上皮组织的反复损伤和修复有关。目前有较多的研究表明，EMT 发生在COPD 气道重塑的过程中。

3.1 COPD 气道上皮细胞中EMT 的形成 Milara等［11］研究表明，吸烟的COPD 患者小支气管的初级人支气管上皮细胞中，典型的上皮间质转换的表达谱增多(间质标记物如α 平滑肌肌动蛋白、波形蛋白和I 型胶原蛋白表达上调，而上皮标记物如E-cad、紧密连接蛋白和细胞角蛋白5/18 下调)。体外研究也显示香烟烟雾提取物刺激不同种类的人支气管上皮细胞，可通过胞内活性氧的激活、TGF-β1的释放、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)和Smad3 的磷酸化作用以及环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)的下调来促进上皮间质的转换。这些新发现表明EMT 可直接被香烟烟雾诱导，EMT 存在于吸烟和COPD 患者的小支气管内，这有可能导致小气道壁的纤维化增厚。

Wang 等［12］在体外实验中，通过将人小气道上皮细胞暴露在香烟烟雾中，测定上皮标志物E 钙黏蛋白和α 连环蛋白，发现二者表达明显减少，并且呈时间依赖改变;而间质标记物N 钙黏蛋白和α 平滑肌肌动蛋白的表达则明显增加。表明小气道上皮细胞中发生了EMT。

3.2 EMT 与COPD 基膜的增厚 基膜位于上皮细胞和内皮细胞的基底部，是细胞外基质的特殊结构形式，将细胞与结缔组织隔离。基膜增厚是气道重塑的主要特征性改变之一。Sohal 等［13］观察到，在COPD 气道重塑过程中，基膜发生破裂增殖、形状拉长和厚度不一，并出现EMT 的改变(间质标志物成纤维细胞蛋白、波形蛋白和MMP-9 表达增多)。Zeisberg 等［14］认为，判断体内EMT 发生的主要依据是网状基膜分裂，转化的上皮细胞迁移至固有层，并伴随有间质标记物的表达，这一现象在Sohal 等［13］的研究中也得以证实。当然，炎症细胞也可表达间质标志物成纤维细胞蛋白、波形蛋白和MMP9［13］。为排除这一干扰，Sohal 等［15］进一步以吸烟的COPD患者为对象，取支气管内活组织制作切片，结果提示，相比浸润性巨噬细胞、中性粒细胞、成纤维细胞或免疫细胞，在基底上皮和网状基膜中，表达间质标志物成纤维细胞蛋白的细胞明显更多。

Soltani 等［16］对伴有或不伴COPD 的吸烟者的支气管组织研究发现，网状基膜中血管丰富、细胞增多，这一现象与血管相关的血管内皮生长因子升高相关，而增殖的细胞被认为是经EMT 转化后的有迁移能力的上皮细胞［13］。Soltani［17］等进一步研究发现，COPD 患者网状基膜中的TGF-β1 表达也明显升高，且是通过p Smad2/3 的表达而被激活。

3.3 EMT 与COPD 细胞外基质的沉积 细胞外基质处于不断代谢更新和降解重塑的动态平衡中，一旦这种平衡被打破，细胞外基质发生沉积，便会引起组织纤维变性［18］。细胞外基质的沉积主要是指胶原蛋白的沉积。细胞外基质的降解和合成主要由MMPs 和金属蛋白酶抑制物(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)来调节。MMP-9、TIMP-1 可由巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞等合成。Brajer等［19］通过对COPD 患者血清MMP-9、TIMP-1 及MMP-9/TIMP-1 比值的测定，发现MMP-9 的浓度显著升高，这些指标的改变与气道阻塞及疾病程度呈正相关，且MMP-9/TIMP-1 的失衡导致细胞外基质代谢紊乱，气道上皮下胶原沉积使气道壁增厚、管腔狭窄，最终发生气道重塑。Vermeer 等［20］对人气道上皮的研究发现，MMPs 家族成员中的MMP-9 可降解层黏连蛋白、纤维结合素等细胞外基质成分以及生长因子前体，从而激活TGF-β、肿瘤坏死因子α等因子，促使上皮下胶原蛋白沉积，从而可能诱发EMT。

4 EMT 在COPD 气道重塑中的发生机制

4.1 TGF-β1 介导的信号通路 已有数据显示COPD 患者气道中TGF-β1 表达增高［21］。TGF-β1是EMT 最重要的感应器，提示极有可能通过TGFβ1 介导EMT 来完成气道重塑。在气道上皮细胞中，TGF-β1 诱导的EMT 是通过几种下游机制来调节的，如活性氧、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)及Smad 信号的产生和激活。其中，TGF-β1 通过Smad2/3 机制诱发EMT的过程涉及转录因子Snail1 和Snail2 的上调，这两种转录因子可抑制黏附连接和紧密连接蛋白的表达［22］。在COPD 的研究中，气道上皮细胞暴露于香烟烟雾和尼古丁后活化的TGF-β1 释放增多，这一过程依赖于活性氧的产生［11］。体外用TGF-β1 刺激肺气道上皮细胞96h 后，检测到细胞形态和分子结构改变，原本呈鹅卵石分布的细胞在TGF-β1 刺激72-96 h 后，呈现出EMT 特有的细胞表型，伴随细胞间连接丢失，细胞拉长，细胞骨架发生改变。黏附连接蛋白E-cad 丢失以及细胞外基质蛋白纤维连接蛋白和I 型胶原沉积，这是EMT 发生的早期生物化学标志。TGF-β1 可减少E-cad mRNA 的表达(在第48 h 下降超过基线值的30%)，并增加纤维连接蛋白和I 型胶原基因的表达(上升趋势呈时间依赖性)［23］。Smad2/3 和p38MAPK 信号通路均被激活，E-cad 下调可通过Smad2/3 或者p38MAPK 信号通路完成，而p38MAPK 通路和纤维连接蛋白上调有关，这两个信号通路均参与调节TGF-β1 诱导的胶原表达。

4.2 活性氧的增多和cAMP 的下调 Milara 等［11］的研究表明，香烟烟雾体外刺激人支气管上皮细胞30 min 后，细胞内活性氧增加，并且这种增加可维持72 h，而72 h 后，细胞内cAMP 减少，且还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化单元氮氧化合物的mRNA和蛋白表达增加，活性氧的产生和氮氧化合物的表达均可被抗氧化物(cAMP 类似物)所抑制，该抑制作用同样存在于cAMP 的减少中，提示活性氧在cAMP 下调过程中起作用。该实验证实香烟烟雾是通过细胞内活性氧的激活、TGF-β1 的释放、ERK1/2 和Smad3 磷酸化作用以及cAMP 的下调来促发EMT 的。鉴于dbcAMP(如β 受体拮抗剂、磷酸二脂酶4 抑制剂)可干扰间质细胞增多以及上皮EMT 标志物丢失，有学者选用磷酸二脂酶4 抑制剂罗氟司特来作进一步的研究。在COPD 和吸烟者的人支气管上皮细胞的体外实验中，罗氟司特氮氧化物可减少间质细胞，并增加上皮表型标志物，从而减轻气道上皮细胞EMT 的发生。在此过程中，罗氟司特氮氧化物修复香烟烟雾刺激引起的细胞cAMP 丢失、减少活性氧。人支气管上皮细胞暴露于香烟烟雾中72h 后，TGF-β1 释放增加，这一增加可被罗氟司特氮氧化物通过减弱ERK1/2 和Smad3 的磷酸化作用来制止［24］。

4.3 尿激酶纤维蛋白溶酶原激活受体(urokinase plasminogen activator receptor，uPAR)表达增多COPD 患者的小气道上皮细胞中uPAR 的表达增多参与了EMT 的发生。Wang 等［12］选取不吸烟组、吸烟组、不吸烟的COPD 组和吸烟的COPD 组患者，测定肺上皮组织中EMT 生物标记物和uPAR 的表达，并通过体外实验验证人小气道上皮细胞中uPAR 在香烟烟雾提取物诱导的EMT 过程中的作用。结果发现uPAR 信号通路参与香烟烟雾提取物诱导的EMT，最终导致COPD 的小气道纤维化。提示COPD患者小气道上皮中uPAR 的表达增加参与激活EMT的过程。然而这一结论受到Sohal 等［1］的质疑，认为该研究中所测定的EMT 生物标记物E 钙黏蛋白和波形蛋白缺乏信服力，因为固有层中的细胞亦表达E 钙黏蛋白，如果这些细胞是从上皮迁移而来，就需要丢失E 钙黏蛋白并表达波形蛋白。

4.4 MMP/TIMP 的失平衡 有研究表明气道上皮是小气道壁接触木材烟雾后白明胶酶合成和分泌的主要来源，并发现MMP9 和MMP2 的高表达在小气道壁的胶原沉积中发挥重要作用［25］。MMP/TIMP 的失平衡可直接将TGF-β 加工成活性配体，并诱导TGF-β1 的生成，从而诱发EMT 的形成。

近期Sohal 等［26］依据COPD 小气道EMT 的概念提出大气道EMT 的假设，发现COPD 患者吸入氟替卡松超过6 个月后，气道上皮中表皮生长因子受体表达减少，分裂的网状基膜长度缩短，表达MMP9、间质标志物成纤维细胞蛋白的细胞数明显减少，证实COPD 气道中吸入皮质激素的抗EMT 作用，同时提示炎症反应机制也参与了EMT 的形成。

5 结 语

综上所述，在COPD 气道炎症损伤修复过程中，上皮细胞通过TGF-β1 介导的信号通路等机制发生了EMT，并参与了基膜的增厚和细胞外基质的沉积，是导致COPD 气道壁的纤维化和管壁增厚的主要因素，在COPD 的气道重塑和持续、渐进的气流受限形成中发挥重要作用。目前有关EMT 的研究主要集中在肿瘤的发生发展、转移以及组织器官纤维化的形成，近来COPD、哮喘气道重塑中的EMT现象引起人类的高度重视，然而EMT 在COPD 气道重塑中的形成机制尚缺少全面的探讨。COPD 发生气道重塑是人类在治疗过程中面临的一大难题，通过抑制或逆转EMT 过程有望成为治疗COPD 气道重塑的新途径。因此，深入研究EMT 在COPD 气道重塑中的发生机制，将有助于COPD 疾病的防治。

［1］ Sohal SS，Walters EH.Role of epithelial mesenchymal transition(EMT)in chronic obstructive pulmonary disease(COPD)［J］.Respir Res，2013，14:120.

［2］ Greenburg G，Hay ED.Epithelia suspended in collagen gels can lose polarity and express characteristics of migrating mesenchymal cells［J］.J Cell Biol，1982，95(1):333-339.

［3］ Bartis D，Mise N，Mahida RY，et al.Epithelial-mesenchymal transition in lung development and disease:does it exist and is it important?［J］Thorax，2014，69(8):760-765.

［4］ 高 璐，吕 刚，孙 凯，等.分化抑制因子1 通过诱导上皮间质转化促进肝癌HepG2 细胞的侵袭性［J］.医学研究生学报，2013，26(12):1254-1257.

［5］ Caja F，Vannucci L.TGFβ:A player on multiple fronts in the tumor microenvironment［J］.J Immunotoxicol，2015，12(3):300-307.

［6］ Moyret-Lalle C，Ruiz E，Puisieux A.Epithelial-mesenchymal transition transcription factors and miRNAs:“Plastic surgeons”of breast cancer［J］.World J Clin Oncol，2014，5(3):311-322.

［7］ Xiao Z，Zhang J，Peng X，et al.The Notch γ-secretase inhibitor ameliorates kidney fibrosis via inhibition of TGF-β/Smad2/3 signaling pathway activation［J］.Int J Biochem Cell Biol，2014，55:65-71.

［8］ Zhang HY，Wang ZQ，Li YY，et al.Transforming growth factorβ1-induced epithelial-mesenchymal transition in human esophageal squamous cell carcinoma via the PTEN/PI3K signaling pathway［J］.Oncol Rep，2014，32(5):2134-2142.

［9］ Kang MH，Oh SC，Lee HJ，et al.The role of PI3K/AKT，MAPK，the NF-kappaB pathway，and MMP-9 expression［J］.Exp Cell Res，2011，317(12):1746-1762.

［10］ McCormack N，Molloy EL，O'Dea S.Bone morphogenetic proteins enhance an epithelial-mesenchymal transition in normal airway epithelial cells during restitution of a disrupted epithelium［J］.Respir Res，2013，14:36.

［11］ Milara J，Peiró T，Serrano A，et al.Epithelial to mesenchymal transition is increased in patients with COPD and induced by cigarette smoke［J］.Thorax，2013，68(5):410-420.

［12］ Wang Q，Wang Y，Zhang Y，et al.The role of uPAR in epithelial-mesenchymal transition in small airway epithelium of patients with chronic obstructive pulmonary disease［J］.Respir Res，2013，14:67.

［13］ Sohal SS，Reid D，Soltani A，et al.Reticular basement membrane fragmentation and potential epithelial mesenchymal transition is exaggerated in the airways of smokers with chronic obstructive pulmonary disease［J］.Respirology，2010，15:930-938.

［14］ Zeisberg M，Neilson EG.Biomarkers for epithelial mesenchymal transitions［J］.J Clin Invest，2009，119:1429-1437.

［15］ Sohal SS，Reid D，Soltani A，et al.Evaluation of epithelial mesenchymal transition in patients with chronic obstructive pulmonary disease［J］.Respir Res，2011，12:130.

［16］ Soltani A，Reid D，Sohal S，et al.Basement membrane and vascular remodelling in smokers and chronic obstructive pulmonary disease:a cross-sectional study［J］.Respir Res，2010，11:105.

［17］ Soltani A，Sohal SS，Reid D，et al.Vessel-Associated Transforming Growth Factor-Beta1(TGF-b1)Is Increased in the Bronchial Reticular Basement Membrane in COPD and Normal Smokers［J］.PLoS One，2012，7(6):e39736.

［18］ 王海燕，何 创，肖建斌，等.转化生长因子-β1 抗体对肺损伤纤维化大鼠细胞外基质重建紊乱的调控［J］.医学研究生学报，2014，27(4):368-372.

［19］ Brajer B，Batura-Gabryel H，NowickaA，et al.Concentration of matrix metalloproteinase-9 in serum of patients with chronic obstructive pulmonary disease and a degree of airway obstruction and disease progression［J］.J Physiol Phamacol，2008，59(6):145-152.

［20］ Vermeer PD，DenkerJ，Estin M，et al.MMP9 modulates tight junction intergrity and cell viability in human airway epithelia［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2009，96(5):L751-L762.

［21］ Gao J，Zhan B.The effects of Ang-1，IL-8 and TGF-beta1 on the pathogenesis of COPD［J］.Mol Med Rep，2012，6(5):1155-1159.

［22］ Yang ZC，Yi MJ，Ran N，et al.Transforming growth factor-β1 induces bronchial epithelial cells to mesenchymal transition by activating the Snail pathway and promotes airway remodeling in asthma［J］.Mol Med Rep，2013，12(6):1663-1668.

［23］ Kolosova I，Nethery D，Kern JA.Role of Smad2/3 and p38 MAP kinase in TGF-β1-induced epithelial-mesenchymal transition of pulmonary epithelial cells［J］.J Cell Physiol，2011，226(5):1248-1254.

［24］ Milara J，Peiró T，Serrano A，et al.Roflumilast N-oxide inhibits bronchial epithelial to mesenchymal transition induced by cigarette smoke in smokers with COPD［J］.Pulm Pharmacol Ther，2014，28(2):138-148.

［25］ Zou Y，Li S，Zou W，et al.Upregulation of gelatinases and epithelial-mesenchymal transition in small airway remodeling associated with chronic exposure to wood smoke［J］.PLoS One，2014，9(5):e96708.

［26］ Sohal SS，Soltani A，Reid D，et al.A randomized controlled trial of inhaled corticosteroids(ICS)on markers of epithelial-mesenchymal transition(EMT)in large airway samples in COPD:an exploratory proof of concept study［J］.Int J Chron Obstruct Pulmon Dis，2014:9:533-542.