理化因子对谷皮菱形藻细胞密度及中性脂含量的影响

班剑娇, 冯 佳, 王志强, 谢树莲

山西大学生命科学学院, 太原 030006

理化因子对谷皮菱形藻细胞密度及中性脂含量的影响

班剑娇, 冯 佳, 王志强, 谢树莲*

山西大学生命科学学院, 太原 030006

以高脂微藻谷皮菱形藻(NitzschiapaleaNY025)为实验材料，探讨了利用光密度法和尼罗红荧光染色法测定细胞生长和细胞中性脂含量的可行性，进而研究了温度、光强及培养基中N、P、Si含量对藻细胞生长和中性脂积累的影响。结果表明：(1)谷皮菱形藻在675nm处存在最大吸收峰，细胞密度与OD675之间存在良好的线性关系，利用光密度法和尼罗红荧光染色法表征谷皮菱形藻生物量和中性脂含量操作简单，适用于高通量样品的测定；(2)谷皮菱形藻在20℃，光强160 μmol m-2s-1时生长最快，在20℃，光强200 μmol m-2s-1时，有利于中性脂积累；(3)培养基中N、P、Si浓度分别为80、120、100 mg/L时，有利于谷皮菱形藻细胞生长，其中，N元素影响最大，其次是P、Si，且N、P、Si三因子以及交互作用N×P与P×Si对藻株生长作用均为显著。培养基中N、P、Si浓度分别为80、120、50 mg/L时，利于中性脂积累，其中，N元素影响最大，其次是Si、P，且因子N、Si及交互作用N×P、N×Si作用均为显著；(4)可采用两步培养法，先使谷皮菱形藻细胞大量增殖，而后适当改变培养条件，以增加脂质合成。

谷皮菱形藻; 理化因子; 细胞密度; 中性脂

随着人类社会不断发展，对能源的需求量越来越大，已导致石油等化石能源紧缺，能源危机问题突显。寻求洁净的可再生能源成为目前的一个重要研究领域。生物柴油作为石油的替代品具有巨大的应用潜力，已引起了广泛关注[1- 3]。

利用微藻资源生产生物柴油具有多方面的优点，如光合效率高，生长速度快，培养周期短，不需要占用大量耕地，而且细胞结构简单，通过生物技术手段易于改造，油脂组成符合生物柴油生产的要求等。因此，微藻也被认为是最有潜力的生物柴油生产原料[4]。

目前，关于微藻的选育已有一些报道[5- 7]。谷皮菱形藻(Nitzschiapalea)隶属于硅藻门(Bacillariophyta)，菱形藻科(Nitzschiaceae)，广泛分布于江河湖海等各种水体中，为广盐性藻种[8]，是一种在水产养殖方面极具经济价值的种类[9]。作者在前期研究中已发现该种具有生长速度快、油脂产率高的特点，是一种较理想的高脂藻种[10]。

硅藻内部的理化成分与其生长的环境相关[11- 12]，温度、光强、pH、培养基成分等的改变都会影响细胞内部脂质含量与组成。利用各种培养条件的优化，可以实现藻细胞内部油脂含量的提升。本文以作者前期筛选的一株高脂谷皮菱形藻为研究对象，进行了温度、光强和培养基中N源、P源、Si源的用量对该藻生长量及中性脂积累量的逐级优化，以期为开发微藻生物柴油种质资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料及培养

谷皮菱形藻(NitzschiapaleaNY025)，分离自山西省汾河上游，为作者前期筛选到的具产油潜力藻株。将实验材料接种至D1培养基进行扩大培养，至对数期时进行后续实验。正交实验中，通过在D1培养基中添加相应量的N源、P源、Si源对该藻株进行优化培养。

1.2 实验方法

1.2.1 OD值与细胞密度线性关系的确立

开启紫外可见分光光度计进行联机操作。取谷皮菱形藻藻液，以D1培养基为对照，进行最大吸收峰的波长扫描，得到最大吸收波长为675nm。选取同一时期不同浓度的藻液，使用血球计数板计数，测定不同浓度藻液OD675值，以OD675为纵坐标，细胞浓度为横坐标，生成相关性曲线，并建立细胞密度与OD675之间的回归方程。

1.2.2 培养温度的选择

设置5个温度梯度，即15，18，20，22，25℃，考察不同温度对谷皮菱形藻生长及中性脂积累的影响。取生长至对数期的藻液，接种至含D1培养基的20 mL试管中，初始接种OD675= 0.07±0.01，置于不同温度的微电脑光照培养箱(SPX- 250B-G型，上海博讯)中静置培养，光强为120 μmol m-2s-1，光暗比12h∶12h，每日摇动数次。每个测定设3个重复。

生长量测定方法：自接种日起，取240μL藻液加入透明的96孔酶标板中，使用酶标仪检测藻液在OD675处的吸光值；中性脂含量测定方法[13- 14]：取240μL藻液加入黑色96孔酶标板中，加入1μL尼罗红染液，混匀后37℃黑暗孵育10min，使用酶标仪检测598nm激发光，543nm散发光处的荧光强度，扣除未接藻的培养基染色后的荧光强度。绘制谷皮菱形藻生长及中性脂积累变化曲线，并通过比较相对吸光值及荧光值增长量得到最佳培养温度。之后在该温度下，进行下一步光照强度的优化。

相对吸光值增长量=(OD675 8-OD675 1)/7

式中,OD675 8为培养第8天时藻液吸光值，OD675 1为接种时藻液吸光值。

荧光值增长量=(L8-L1)/7

式中,L8为培养第8天时藻液荧光值，L1为接种时藻液荧光值。

1.2.3 光照强度的选择

设置3个光强梯度，120、160、200 μmol m-2s-1，考察不同光强对谷皮菱形藻生长及中性脂积累的影响。取一定量的藻液，接种至含D1培养基的20 mL试管中，初始接种OD675=0.125±0.01，置于不同光强的培养箱中培养，温度为20℃，每个测定设3个重复。生长量与中性脂含量变化测定方法同1.2.2。选用中性脂积累量最大时的光强，进行下一步实验。

表1 正交实验因子的水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 N、P、Si三因素正交实验

N源、P源、Si源分别选用NaNO3、K2HPO4与KH2PO4、Na2SiO3·9H2O。根据文献[12- 13]并基于D1培养基配方，设计N、P、Si三因素三水平正交实验(表1)。实验选用L27(313)正交设计表(表2)。配制27组添加不同含量N、P、Si的培养液。取对数期的藻液，离心并用各组培养基清洗两次，再将离心收集的材料分别接种于对应的培养基中，每组设3个平行。置于光照培养箱中培养，光强为200 μmol m-2s-1，温度为20℃。

表2 正交实验结果Table 2 The results of orthogonal experiment

测定藻株在不同培养条件下的吸光值与荧光值增长量，绘制相应曲线。吸光值增长量=(OD675 10-OD675 1)，OD675 10为培养第10天时藻液吸光值，OD675 1为接种时藻液吸光值，荧光值增长量=(L10-L1)，L8为培养第10天时藻液荧光值，L1为接种时藻液荧光值。参照相关文献[15]对结果进行方差分析，得出谷皮菱形藻生长及中性脂积累的最优N、P、Si水平组合。

2 研究结果

2.1 OD值与细胞密度的线性关系

谷皮菱形藻藻液的波长扫描显示(图1)，在675nm处存在最大吸收峰。且在60s内，谷皮菱形藻沉降不明显(图2)，短时间内不影响吸光值的测定。谷皮菱形藻的细胞密度与光密度OD675之间，存在良好的线性关系(图3)，相应的回归方程为OD675=0.10179C-0.00247，线性相关系数为R2=0.99782。因此可通过测定OD675来间接表示细胞密度，进而表征藻株生长状况。

图1 谷皮菱形藻的光谱扫描图

图2 OD675随时间的变化曲线

图3 吸光度与细胞密度的标准曲线

2.2 不同温度下谷皮菱形藻生长量及中性脂含量

图4显示了不同温度下，谷皮菱形藻的生长情况。可以看出谷皮菱形藻在各个温度条件下均能生长，但生长速度有一定差异。5个温度梯度下的吸光值增长量，可以看出藻株的生长量先上升后下降，在20℃时达到最大。

图4显示了不同温度下，谷皮菱形藻的荧光值变化情况。可以看出荧光值含量变化不大。5个温度梯度下的荧光值增长量，结果显示，藻株中性脂含量先升高后下降，在20℃下中性脂产量最大。

图4 温度对谷皮菱形藻生长及中性脂含量的影响

2.3 不同光照强度下谷皮菱形藻生长量及中性脂含量

图5显示了在120、160、200 μmol m-2s-1光强下，谷皮菱形藻的生长情况。可以看出谷皮菱形藻在不同光强下的生长趋势相似，生长速度差异不大。3个光强梯度下的吸光值增长量，可以看出藻株在160 μmol m-2s-1时生长量达到最大。

图5显示了不同光强下，谷皮菱形藻的荧光值变化情况。可以看出荧光值含量随着时间的延长而增加。3个光强梯度下的荧光值增加量，结果显示，在200 μmol m-2s-1时中性脂产量最大。

图5 光照强度对谷皮菱形藻生长及中性脂含量的影响

2.4 培养基N、P、Si正交实验结果

由正交实验结果(表2)可以看出，对于藻株吸光值增长量来说，极差RN>RP>RSi，即N含量对藻株生长影响最大，其次为P，最后是Si，对于T值来说，N2P1Si1最大，因此最佳组合为N2P1Si1，即N、P、Si浓度分别为80、120 、100 mg/L时，谷皮菱形藻生长量最大。而对于藻株荧光值增长量来说，极差值RN>RSi>RP，即N对中性脂积累影响最大，Si次之，P影响最小，根据t值可知，N2P1Si3最大，因此最佳组合为N2P1Si3，即当培养基中N、P、Si浓度分别为80、120、50 mg/L时，谷皮菱形藻的中性脂积累最多。

根据正交实验结果，进行了方差分析，N、P、Si对谷皮菱形藻生长影响的方差分析如表3所示。由结果可知，FN、FP、FSi、FN×P、FP×Si均大于Fα，因此N、P、Si三因子以及交互作用下N×P与P×Si作用均为显著，因子N×Si作用不显著。各因素的最优水平为N2P1Si1，此时谷皮菱形藻生长量达到最大。表4中的结果显示了N、P、Si对谷皮菱形藻中性脂产量影响的方差分析，FN、FSi、FN×P、FN×Si均大于Fα，因此因子N、Si及交互作用下N×P、N×Si的作用均为显著，因子P与P×Si作用不显著，N2P1Si3的均值最大，为最有利于中性脂积累的水平组合。

表3 正交实验对谷皮菱形藻生长影响的方差分析Table 3 ANOVA of orthogonal experiment for effects of N, P, Si on the growth of Nitzschia palea

3 讨论

谷皮菱形藻最大吸收峰的波长为675nm，藻液细胞密度不同，其色素含量也不同，因而吸光值也有差异[16]。由研究结果可知，细胞密度与光密度OD675之间，存在良好的线性关系，因此利用光密度法代替细胞计数来表征谷皮菱形藻生物量是可行的，且该方法操作步骤简单，数据准确，有利于高通量样品的计数。本文使用尼罗红荧光染色法来间接表示细胞中性脂的含量，无需对样品进行干燥、破碎，操作简单，尤其适用于高通量样品的测定，需要注意的是操作应在较暗环境下进行，以防荧光淬灭。

表4 N、P、Si对谷皮菱形藻中性脂产量影响的方差分析Table 4 ANOVA of orthogonal experiment for effects of N, P, Si on neutral lipid accumulation of Nitzschia palea

培养温度的变化对藻细胞生长与脂质积累都有较大的影响。本文研究结果显示在温度为20℃时，最有利于谷皮菱形藻生长量与中性脂的积累，这与陈书秀等[17]的研究结果是一致的。Renaud[18]也报道过，在20℃时最适于小新月菱形藻Nitzschiaclosterium与铲状菱形藻N.paleacea的生长与脂质积累，这是由于温度过高或过低都将影响藻细胞内各种酶的活性，温度最适时，酶活性最高，此时细胞生长与脂质积累达到平衡。最佳生长和脂质积累温度是20℃，也提示我们，在进行谷皮菱形藻大量培养时，不仅可以采用密闭式光反应器培养，也有可能在合适的季节进行室外开放式跑道池培养，以降低成本。

本文的研究结果显示，在光强为160 μmol m-2s-1时最有利于谷皮菱形藻的生长，而中性脂积累的最佳光强要高于此值。早在1974年Orcutt就发现，高光强能促进Nitzschiacloserium细胞内甘油三酯的合成[19]，其他学者也有类似报道[20- 21]，可见适当增加光强可以有效促进中性脂的积累。有报道指出微藻中性脂大量积累一般发生于稳定期[22]，即晚于细胞增殖最快的对数期，这也提示人们在实际应用中可以采用两步培养法，先在光强160 μmol m-2s-1下培养，以使细胞大量增殖，而后再增加光强培养，以使中性脂得到大量合成。

正交实验的分析结果显示，对于藻细胞生长，N元素影响最大，其次是P、Si，且N、P、Si三因子以及交互作用N×P与P×Si对藻株生长作用均为显著，因此在藻株培养过程中，三因子都应该重点考虑。N、P、Si浓度分别为80、120、100mg/L时，生长最好。对于中性脂积累，N影响最大，其次是Si、P，且因子N、Si及交互作用N×P、N×Si作用均为显著，因此基于中性脂积累的藻株培养中，N、Si应优先考虑。N、P、Si的含量分别为80、120、50 mg/L时，最利于藻细胞中性脂积累。N缺乏与Si缺乏在一定程度上可以增大中性脂的积累，可能是因为氮素的缺乏导致蛋白质合成的减少，从而使代谢途径朝脂肪和碳水化合物方向发展，而Si的缺乏被认为是促使某种合成脂质的酶活性增强，导致脂质含量增加[23]。这也再次提示我们，在采用两步培养时，可以先以细胞增殖为目的，而后再降低Si浓度，以增加脂质合成。

4 结论

(1)谷皮菱形藻在675nm时，细胞密度与光密度OD675之间，存在良好的线性关系，利用光密度法表征谷皮菱形藻生物量步骤简单，数据准确，有利于高通量样品的计数。采用尼罗红荧光染色法间接表示细胞中性脂的含量，无需对样品进行干燥、破碎，操作简单，适用于高通量样品的测定。

(2)谷皮菱形藻在20℃，光强160 μmol m-2s-1时生长最快，在20℃，光强200 μmol m-2s-1时，最有利于脂质积累。

(3)培养基中N、P、Si浓度分别为80、120、100 mg/L时，有利于谷皮菱形藻细胞生长，其中，N元素影响最大，其次是P、Si，且N、P、Si三因子以及交互作用N×P与P×Si对藻株生长作用均为显著。培养基中N、P、Si浓度分别为80、120、50 mg/L时，利于中性脂积累，其中，N元素影响最大，其次是Si、P，且因子N、Si及交互作用N×P、N×Si作用均为显著。

(4)可采用两步培养法，先使谷皮菱形藻细胞大量增殖，而后适当改变培养条件，以增加脂质合成。

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Effects of physical and chemical factors on the growth and neutral lipid content ofNitzschiapalea

BAN Jianjiao, FENG Jia, WANG Zhiqiang, XIE Shulian*

SchoolofLifeScience,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China

An algal strain,NitzschiapaleaNY025, was chosen as experimental materials for its high-lipid content. The feasibility of optical density method used for cell growth determination was investigated first. Then Nile red fluorescence was used for determining the relative neutral lipid contents because neutral lipid content was a key standard of choosing algae in biodiesel production. Furthermore, the effects of temperature, light intensity, nitrogen, phosphorus and silicon on the cell growth and neutral lipid contents ofN.paleawere investigated. The results showed that: (1) The maximum absorption ofN.paleaexisted at 675nm, and the absorption showed a good linear relationship with cell density. Therefore, the growth ofN.paleacould be obtained by measuring OD675. Optical density method and Nile red fluorescence possessed advantage of simple operation, so they were suitable for high-throughput sample analysis. (2) The optimum temperature was 20℃ for increasing the cell density and neutral lipid content ofN.palea. The finest light intensity for the growth ofN.paleawas 160 μmol m-2s-1, while the best light intensity for neutral lipid accumulation was 200 μmol m-2s-1. It is suggested that increasing light intensity appropriately might increase neutral lipid contents in algal cells. (3) Under the optimum temperature and light intensity, the orthogonal experiments of nitrogen, phosphorus and silicon were designed to research into their effects on the growth and neutral lipid contents ofN.palea. The influence of nitrogen on the growth ofN.paleawas the most significant, then the factor phosphorus and the last one was factor silicon. The growth ofN.paleawas influenced significantly by factors nitrogen, phosphorus, silicon and interaction factors nitrogen with phosphorus, nitrogen with silicon. The optimum growth rate was obtained when the content of nitrogen, phosphorus and silicon were 80 mg/L, 120 mg/L and 100 mg/L, respectively. The influence of factor nitrogen on neutral lipid accumulation was the most significant, next was factor silicon and the last one was factor phosphorus. Neutral lipids accumulation was influenced significantly by factors nitrogen, silicon and interaction factors nitrogen with phosphorus, nitrogen with silicon. The maximum neutral lipid accumulation was obtained when the concentration of nitrogen, phosphorus and silicon were 80 mg/L, 120 mg/L and 50 mg/L, respectively. (4) In conclusion, the lipid synthesis can be improved by two-step method. First the cell density ofN.Paleawas increased, and after gathering plenty of cells the culture conditions changed to increase neutral lipid contents.

Nitzschiapalea; physical and chemical factors; cells density; neutral lipid

2013- 06- 21;

2014- 05- 30

10.5846/stxb201306211754

*通讯作者Corresponding author.E-mail: xiesl@sxu.edu.cn

班剑娇, 冯佳, 王志强, 谢树莲.理化因子对谷皮菱形藻细胞密度及中性脂含量的影响.生态学报,2015,35(10):3349- 3356.

Ban J J, Feng J, Wang Z Q, Xie S L.Effects of physical and chemical factors on the growth and neutral lipid content ofNitzschiapalea.Acta Ecologica Sinica,2015,35(10):3349- 3356.