原发性胆汁性肝硬化临床特点及其与人巨细胞病毒感染的相关性

赵素贤，张玉果，李文聪，王荣琦，南月敏*，赵景民

(1.河北医科大学第三医院中西医结合肝病科，河北 石家庄 050051；2.中国人民解放军第三零二医院病理诊断中心，北京 100039)



·论 著·

原发性胆汁性肝硬化临床特点及其与人巨细胞病毒感染的相关性

赵素贤1，张玉果1，李文聪1，王荣琦1，南月敏1*，赵景民2

(1.河北医科大学第三医院中西医结合肝病科，河北 石家庄 050051；2.中国人民解放军第三零二医院病理诊断中心，北京 100039)

目的探讨原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)临床、血清学特点及其与人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)之间的相关性。方法收集PBC患者45例、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者60例和健康献血者(正常对照组)70例，比较3组血清检测指标和HCMV DNA。结果PBC组和CHB组丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase，AST)、总胆红素(serum total bilirubin，TBil)、直接胆红素(direct bilirubin，DBil)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、IgM高于正常对照组，白蛋白(albumin，Alb)低于正常对照组，PBC组γ-谷氨酰转移酶(glutamyl transpeptidase，γ-GT)高于正常对照组(P<0.05)；PBC组AST、TBil、DBil、ALP、γ-GT、TC、TG、IgM 高于CHB组(P<0.05)。3组抗HAV-IgM、抗-HCV、抗-HDV、抗HEV-IgM及抗HEV-IgG、抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)、抗肝肾微粒体抗体(anti-liver-kidney microsomal antibody，LKM)均为阴性，IgG、IgA均在正常范围内。3组HCMV DNA阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)，两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论PBC患者临床表现以胆汁淤积性改变为主，对于抗线粒体抗体阴性的患者需通过病理学确诊，肝病患者易感染HCMV。

肝硬化，胆汁性；乙型肝炎,慢性；巨细胞病毒

原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是一种原因不明的慢性炎症性和胆汁淤积性肝脏疾病。它以血清中存在针对线粒体内膜抗原的自身抗体即抗线粒体抗体(anti-mitochondrial antibodies，AMA)、肝脏内进行性小胆管损坏伴门管区炎症、慢性胆汁淤积和肝纤维化为特点，并可最终进展至肝硬化和肝衰竭，肝移植是惟一的有效治疗方法。该病主要发生在中年女性，常并发各种肝外器官特异性自身免疫性疾病如自身免疫性甲状腺疾病、干燥综合征、类风湿性关节炎等[1]。其确切的发病机制和病因不太清楚，目前有研究表明与分子模拟机制有关的感染因素在发病机制中的地位很重要，通过在Genbank中序列对比后发现人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)序列与AMA有高度同源性，提示HCMV可能在PBC的发病过程中起重要作用。本研究对45例资料完整行肝穿刺的PBC患者的临床及血清学特点进行分析，检测PBC患者血清中HCMV DNA，旨在探讨HCMV感染与PBC之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集河北医科大学第三医院及中国人民解放军第三零二医院经病理确诊的临床资料完整的PBC患者45例，男性5例，女性40例，年龄11～75岁，平均(43.5±6.1)岁。PBC的诊断标准[2]: ①碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)等指标升高；②上腹部B超、内镜逆行性胰胆管造影术和磁共振胰胆管造影检查示胆管正常；③AMA和(或)AMA-M2亚型阳性；④如果血清AMA/AMA-M2阴性，病理检查符合PBC的改变，除外肥胖、酒精、病毒、药物等因素所引起的肝损者。另选择同期慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者60例作为CHB组、健康献血者70例作为正常对照组。CHB组男性8 例，女性52例，年龄23～76岁，平均(43.2±6.3)岁；正常对照组男性11例，女性59例，年龄20～56岁，平均(44.3±7.0)岁。3组性别、年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 肝脏生化及免疫学指标检测 应用奥林巴斯AU5400 全自动生化分析仪检测丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase，AST)、ALP、γ-谷氨酰转移酶(glutamyl transpeptidase，γ-GT)、总胆红素(serum total bilirubin，TBil)、直接胆红素(direct bilirubin，DBil)、白蛋白(albumin，Alb)、球蛋白(globulin，Glob)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)等。采用酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测抗甲型肝炎病毒IgM抗体(anti-hepatitis A virus IgM antibody,抗HAV IgM)、乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)、抗乙型肝炎病毒表面抗体(anti-hepatitis B virus surface antibody,抗-HBs)、抗乙型肝炎病毒核心抗体(anti-hepatitis B core antigen,抗-HBc)、乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)、抗乙型肝炎病毒e抗体(anti-hepatitis B e antigen,抗-HBe)、抗丙型肝炎病毒抗体(anti-hepatitis C virus antibody，抗-HCV)、丁型肝炎抗体(anti-hepatitis D virus antibody，抗-HDV)、抗戊型肝炎病毒IgM抗体(anti-hepatitis E virus IgM antibody,抗HEV-IgM)及抗戊型肝炎病毒IgG抗体(anti-hepatitis E virus IgG antibody,抗HEV-IgG)。采用免疫荧光法检测抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)、抗肝肾微粒体抗体(anti-liver-kidney microsomal antibody，LKM)、AMA及分型、免疫球蛋白(IgG，IgA，IgM)。

1.3 血清HCMV DNA提取 小量基因组DNA极速抽提试剂盒DNA fast 2000(上海飞捷生物技术有限公司)，HCMV PCR 引物由北京赛百盛公司合成。引物设计根据HCMV(AD169株)早期基因外显子设计。外引物：5′端引物为5′-ATGGAGTCCTCTGCCAAGAG-3′；3′端引物为5′-CAATACACTTCATCT CCTCG-3′；扩增片段为721 bp。内引物：5′端引物为5′-GTGACCAAGG-CCACG ACGTT-3′；3′端引物为5′-TCTGCCAGG-ACATCTTTCTC-3′；扩增片段为167 bp。

1.4 套式PCR检测 HCMV DNA 50μL反应体系，10×dNTP 5 μL，模板DNA 2 μL，Taq DNA聚合酶 1 μL，Buffer 5 μL，上下游引物各1 μL，水补足50 μL。第1次PCR反应为2 μL模板DNA加入50 μL HCMV反应体系(含外引物)，94 ℃ 3 min,94 ℃ 40 s,52 ℃ 150 s，72 ℃ 40 s，扩增 35个循环后，72 ℃延伸 8 min；2 μL PCR产物加入第2次PCR反应体系(含内引物)中，94 ℃ 3 min,94 ℃ 40 s，52 ℃ 150 s，72 ℃ 40 s，扩增 35个循环后，72 ℃延伸3 min。扩增产物于2%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察以出现167 bp扩增片段为阳性，设立阴性对照，HCMV DNA阳性对照由中国疾病控制中心病毒研究所提供。

2 结 果

2.1 PBC的临床表现 PBC起病隐匿，中年女性多见，共同特征是黄疸、瘙痒症状明显，肝炎病毒标记物阴性。45例PBC患者中临床表现为乏力39例(86.7%)、黄疸35例(77.8%)、瘙痒30例(66.7%)、脾大25例(55.6%)。并发自身免疫性疾病4例，其中溃疡性结肠炎1例、桥本甲状腺炎2例、干燥综合征1例。

2.2 血清学检测 PBC组和CHB组ALT、AST、TBil、DBil、ALP、TC、TG、IgM高于正常对照组，Alb低于正常对照组，PBC组γ-GT高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，CHB组γ-GT与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；PBC组AST、TBil、DBil、ALP、γ-GT、TC、TG、IgM 高于CHB组，差异有统计学意义(P<0.05)，ALT和Alb与CHB组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

PBC组AMA阳性32例(71.1%)，CHB组、正常对照组AMA均为阴性。3组抗HAV-IgM、抗-HCV、抗-HDV、抗HEV-IgM及抗HEV-IgG、ANA、LKM均为阴性，IgG、IgA均在正常范围内。

表1 PBC组、CHB组及正常对照组血清学检测比较

组别例数ALT(U/L)AST(U/L)TBil(μmol/L)DBil(μmol/L)ALP(U/L)PBC组45103.0±30.1*93.2±32.4*#46.7±5.5*#29.1±6.3*#419.0±140.5*#CHB组60108.4±34.2*111.7±23.1*42.1±18.2*22.3±8.1*70.0±21.2*正常对照组7021.0±3.117.0±2.610.7±1.13.2±0.752.0±4.6 F239.316357.73194.168327.850413.564 P0.0000.0000.0000.0000.000组别例数γ-GT(U/L)Alb(g/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)IgM(g/L)PBC组45475.5±170.3*#38.1±4.3*6.9±3.2*#1.8±0.7*#5.8±2.7*#CHB组6047.0±8.439.2±5.8*5.3±1.6*1.0±0.9*2.7±0.6*正常对照组7027.0±5.347.5±4.33.9±1.20.7±0.21.9±0.3 F433.46568.86830.49340.32878.695 P0.0000.0000.0000.0000.000

*P<0.05与正常对照组比较 #P<0.05与CHB组比较(q检验)

2.3HCMVDNA检测 3组HCMVDNA阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)，两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2，图1。

表2 3组HCMV DNA阳性率比较

图1 3组CMVDNA检测结果

Figure1ResultsofCMVDNAdetectioninthreegroups

3 讨 论

本研究PBC患者均经病理确诊，其特点为好发于中年女性，以γ-GT、ALP升高等胆汁淤积性变化为主，并且IgM升高，符合2009年美国肝病学会制定的PBC诊断标准。与国外报道一致[3]。考虑雌激素诱导的胆汁淤积可能与PBC有关。研究表明雌激素在PBC发生发展及临床表现中起重要作用，在淋巴细胞成熟、激活、合成抗体及细胞因子扮演重要角色[4]，胆管上皮细胞表达雌激素受体，因此妊娠可出现PBC所致的胆汁淤积，同时外源性激素在PBC发病中起了一部分作用[5]。关于性别与临床表现报道少见，英国的研究表明男性、女性患者寿命基本相同，男性患者瘙痒症状出现少，但肝癌发生率高[6]。研究结果表明男性很少并发自身免疫性疾病，预后好，同样肝癌发生率高[7]。以上均提示男性PBC患者应注意监测肿瘤的发生。本研究结果显示PBC并发溃疡性结肠炎、桥本甲状腺炎、干燥综合症，与文献报道一致[8]，因此诊治过程中需注意鉴别是否并发其他自身免疫性疾病。

PBC患者血清中存在针对线粒体内膜抗原的自身抗体即AMA，是PBC的血清学标记物。本研究中AMA阳性率为71.1%，低于其他学者报道的95%[9]。其原因可能是部分病例为AMA阴性，由肝穿刺病理确诊。提示怀疑为PBC的AMA阴性患者，有必要通过病理确诊。此外，可能与检测方法的灵敏度有关[10]，应用敏感的MIT3ELISA试剂盒检测，90%AMA阴性患者可检测出AMA。有报道AMA阴性患者ALP水平低，很少出现瘙痒，但易并发自身免疫性疾病[10]。文献报道AMA阴性与AMA阳性患者在性别、年龄、乏力、黄疸和皮肤瘙痒症状的发生率及其他各项检查结果方面差异无统计学意义[11]。最近的研究显示AMA阳性患者可溶性CTLA-4水平明显高于阴性患者，表明二者的免疫状态不同[12]。

本研究表明乏力、瘙痒是PBC患者的主要症状，因此PBC患者生活质量差[13]。一项9年的纵向研究显示，研究初期出现乏力者生存期较未出现者短，只有肝移植可改善患者乏力症状，但很大一部分患者移植术后2年会再次瘙痒[14]。瘙痒的机制目前尚不明确，考虑与组胺、5-羟色胺、胃肠激素等有关[15]。此外，胆汁淤积性瘙痒可能与溶血磷脂酸有关[16]，小鼠皮下注射溶血磷脂酸可出现搔抓反应，这为胆汁淤积相关性瘙痒治疗提供了新的方向；本研究结果显示PBC患者γ-GT、ALP、TBil、DBil和IgM显著升高，与文献报道一致[10]，TC、TG平均值高于正常水平可能与脂质代谢障碍有关。

目前PBC的发病机制尚不清楚，有研究认为可能与感染因素有关，病原体可能通过分子模拟导致机体免疫耐受丧失，从而参与PBC的发病[17]。分子模拟是指机体受到病原微生物感染或接触化学物品时，由于病原微生物的某些抗原表位与人体自身组织蛋白的抗原表位相同或相似，导致机体对自身抗原免疫耐受丧失，刺激机体产生激活的淋巴细胞或抗体与组织抗原发生交叉反应，导致组织器官的损伤，病毒被认为是很多自身免疫性疾病的可能性病因，如风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化等。在PBC中尚未见报道明确的病毒感染与其发病相关。由于PBC患者的特征性抗体AMA抗体与CMV的序列有高度同源性，因此本研究检测了PBC患者血清中HCMV的阳性率，血清HCMVDNA是活动性感染的标志，HCMVDNA阳性血清中存在游离的HCMV。PCR法是目前敏感度高的基因检测手段之一，用套式PCR检测血清和白细胞的HCMVDNA，能较好地反映机体HCMV带病毒状态。本研究结果显示，PBC组、CHB组HCMVDNA阳性率均高于健康对照组，PBC组与CHB组的阳性检出率差异无统计学意义。提示肝病患者易患HCMV感染，在治疗过程中应给予重视。

总之，PBC是一种原因不明的慢性自身免疫性肝脏疾病。临床症状无特征性，可表现为现乏力、黄疸、瘙痒，可并发自身免疫性疾病；实验室检查可表现为γ-GT、ALP、TBil和IgM显著升高，AMA阳性。随着临床医师对该病的临床及病理学认识加深，其早期诊断明显提高。虽然熊去氧胆酸是治疗PBC的安全有效药物，但尚有治疗不佳的患者。因此，仍需进一步研究其发病原因，为临床的有效治疗提供依据。

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(本文编辑：赵丽洁)

Characteristics of primary biliary cirrhosis and its relationship with human cytomegalovirus

ZHAO Su-xian1,ZHANG Yu-guo1,LI Wen-cong1,WANG Rong-qi1,NAN Yue-min1*,ZHAO Jing-min2

(1.Department of Traditional and Western Medical Hepatology,the Third Hospital of HebeiMedical University,Shijiazhuang 050051,China；2.Department of Pathology,the 302 Hospital of PLA,Beijing 100039,China)

Objective To explore the clinical features of primary biliary cirrhosis(PBC) and the association between PBC and human cytomegalovirus(HCMV).Methods The nested polymerase chain reaction was used to detect serum HCMV DNA from 45 PBC patients,60 chronic hepatitis B(CHB) patients and 70 healthy blood donors.The data of three groups were analyzed.Results ALT,AST,TBil,DBil,ALP,TC,TG,IgM,Alb in PBC group and CHB group were significantly higher than those in normal control group,while Alb was lower than that in normal control group(P<0.05).γ-GT in PBC group was higher than that in normal group(P<0.05).AST,TBil,DBil,ALP,γ-GT,TC,TG and IgM in PBC group were higher than those of CHB group(allP<0.05).All anti-HAV-IgM,anti -HCV,anti-HDV,anti-HEV-IgM,anti HEV-IgG,ANA and anti-LKM in three groups were negative,but IgG and IgA were all in normal range.The seroprevalence of HCMV DNA among three groups showed statistic significance(P<0.05),but there was no significant difference between PBC group and healthy group(P>0.05).Conclusion Cholestasis was the main clinical feature of PBC.The pathological diagnosis was necessary for anti-mitochondrial antibodies negative patients.The results suggested that patients with liver diseases were susceptible to HCMV.

liver cirrhosis,biliary；hepatitis B,chronic；cytomegalovirus

2015-04-01；

2015-06-01

河北省医学科学研究重点课题(20130219)；河北省中医药类科研计划课题(2013016；2014143)；中国肝炎防治基金天晴肝病研究基金项目(TQGB20140203)

赵素贤(1976-)，女，河北高邑人，河北医科大学第三医院主治医师，医学博士研究生，从事肝脏疾病诊治研究。

*通讯作者。E-mail：nanyuemin@163.com

R575.22

A

1007-3205(2015)11-1259-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2015.11.006