当归四逆汤对心肌缺血大鼠血清一氧化氮及心肌一氧化氮合酶活性表达的影响

张戟风，刘秀丽，王国明，王永利

(1. 沧州医学高等专科学校，河北 沧州 061001；2. 河北医科大学，河北 石家庄 050011)

当归四逆汤对心肌缺血大鼠血清一氧化氮及心肌一氧化氮合酶活性表达的影响

张戟风1，刘秀丽1，王国明1，王永利2

(1. 沧州医学高等专科学校，河北 沧州 061001；2. 河北医科大学，河北 石家庄 050011)

目的观察当归四逆汤对实验性心肌缺血模型大鼠血清一氧化氮(NO)及心肌一氧化氮合酶(eNOS)活性的影响，为临床应用本方防治冠心病提供实验依据。方法将50只雄性Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、当归四逆汤低剂量组[5g生药/(kg·d)]、当归四逆汤高剂量组[10g生药/(kg·d)]和复方丹参滴丸组[0.081g/(kg·d)]，每组10只。各给药组均按30mL/kg灌胃给予相应药物，空白组和模型组灌胃同体积蒸馏水，1次/d,连续5d。末次灌胃后1h,除空白组腹腔注射生理盐水外，其余组均腹腔注射垂体后叶素30IU/kg。注射后1h处死大鼠，测定各组血清一氧化氮(NO)水平，并取心尖部心肌组织采用免疫组化法检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性。结果模型组血清NO水平明显低于空白组(P<0.05)，各给药组血清NO水平显著高于模型组(P均<0.05)，当归四逆汤低剂量组和高剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。光镜下显示，模型组eNOS活性弱于空白组，而各给药组eNOS活性均强于模型组。结论当归四逆汤可提高心肌缺血模型大鼠心肌组织eNOS活性，促进内源性NO生成和释放，从而发挥抗垂体后叶素所致大鼠心肌缺血作用。

当归四逆汤；心肌缺血；垂体后叶素；一氧化氮；一氧化氮合酶

近年来随着人们生活水平的提高，冠心病的发病率有逐渐增高的趋势，已成为威胁人类健康的重要疾病之一。目前该病主要采取药物治疗、手术治疗、介入治疗、基因治疗等，虽有长足进步，但病死率仍居高不下，西药的不良反应也显现出来，且介入治疗也存在再狭窄、再栓塞的问题。中医认为冠心病属于中医学“胸痹”“真心痛”的范畴，心阳虚是冠心病的主要病理基础。心阳不足，无力推动血行，其气也弱，使邪有所踞，固可产生血瘀导致疼痛。当归四逆汤具有和厥阴、散寒邪、调营卫以通阳气的功效，用于治疗本病疗效较好。复方丹参滴丸为理血剂，具有活血化瘀、理气止痛之功效，主治气滞血瘀所致的胸痹，证见胸闷、心前区刺痛，冠心病心绞痛见上述证候者，临床疗效显著。故本研究以复方丹参滴丸为对照药物，观察当归四逆汤对实验性心肌缺血模型大鼠血清一氧化氮(NO)及心肌一氧化氮合酶(eNOS)活性的影响，旨在为临床应用本方防治冠心病提供实验依据。

1 实验资料

1.1动物 成年健康雄性Wistar大鼠，体质量(200±30)g，由河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：1012001。取心电图检查无异常者50只，实验前适应性喂养1周。

1.2试剂 NO试剂盒(批号：101018)、内皮型eNOS免疫组化试剂盒(批号：101019)均购自南京建成生物工程研究所。

1.3药物 当归四逆汤由当归12 g、桂枝9 g、芍药9 g、细辛3 g、通草6 g、炙甘草6 g、大枣5 g组成，为成人(60 kg计)一日剂量，再根据人与动物用药量体表面积换算法折算大鼠剂量。上述饮片均购自沧州市同仁堂中药店，经沧州市药检所鉴定均为正品，符合国家药品标准规定。上述饮片以水浸渍30 min后，水提3次，合并滤液，浓缩成含生药0.5 g/mL和1.0 g/mL浓度的药液，低温保存备用。垂体后叶素注射液为南京新百药业有限公司生产，批号：100405，规格6 IU/mL。复方丹参滴丸为天津天士力制药股份有限公司生产，批号：100721，规格：27 mg/粒，按照成人用量(810 mg/d)，再根据人与动物用药量体表面积换算法计算大鼠用量，临用时以温蒸馏水溶化成8.10 mg/mL浓度的药液。

1.4仪器与设备 Citadel 2000型脱水机、Histocentrez型包埋机，英国姗顿公司生产；YD-1508A型切片机，浙江金华益迪医疗设备厂生产。BL-420生物机能实验系统、TM-WAVE生物信号采集与分析软件，成都泰盟科技有限公司生产；TDL-50B型离心机，上海安亭科学仪器厂生产；Humalyzer 2000型半自动生化分析仪，美国生产；微波仪，浙江临安电子器材厂生产； DMIL-RF-1型倒置荧光显微镜，德国莱卡生产。

1.5动物分组处理及模型制备 将50只雄性大鼠随机分成空白组、模型组、当归四逆汤低剂量组[5 g生药/(kg·d)]、当归四逆汤高剂量组[10 g生药/(kg·d)]和复方丹参滴丸组[复方丹参滴丸0.081 g/(kg·d)]，每组10只。分组后，各给药组均按30 mL/kg剂量灌胃给予相应药物，正常组和模型组均按体质量给予同体积蒸馏水，每天1次，连续5 d。实验第5天灌胃给药后1 h，参照文献[1]方法，除空白组腹腔注射生理盐水外，其余各组均按体质量腹腔注射垂体后叶素注射液30 IU/kg。

1.6检测指标及方法 ①在注射后1 h处死各组大鼠，颈动脉取血，3 000 r/min离心10 min，按试剂盒提供的方法(硝酸还原酶法)测定血清NO含量。②大鼠处死后，立即取心尖同一部位心肌组织，生理盐水冲洗后，置于10%中性福尔马林溶液中固定，经过磷酸盐缓冲液冲洗、乙醇脱水等处理后，石蜡包埋，制备石蜡切片，采用免疫组织化学法检测eNOS活性。光学显微镜下观察阳性部位为棕黄色，通过棕黄色表达的面积来体现阳性强弱。

1.7统计学方法 数据采用SPSS 17.0软件处理，计数资料采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组血清NO水平比较 空白组血清NO水平为(63.77±21.26)μmol/L，模型组为(19.47±10.73)μmol/L，当归四逆汤低剂量组为(39.16±10.58)μmol/L，当归四逆汤高剂量组为(48.24±18.21)μmol/L，复方丹参滴丸组为(51.24±22.5)μmol/L。模型组血清NO水平明显低于空白组(P<0.05)，各给药组血清NO水平均显著高于模型组(P均<0.05)，当归四逆汤低、高剂量组与复方丹参滴丸组组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

2.2各组大鼠心肌eNOS活性比较 光学显微镜下显示，模型组eNOS活性弱于空白组。各给药组eNOS活性均强于模型组，当归四逆汤低、高剂量组与复方丹参滴丸组组间比较无明显差异。见图1～5。

图1 空白组心肌组织eNOS活性(×200)

图2 模型组心肌组织eNOS 活性(×200)

3 讨 论

当归四逆汤原治厥阴伤寒，方中当归补血和血，桂枝温经散寒，为君药；细辛助桂枝温通血脉，白芍助当归补益营血，共为臣药；通草通经畅血，大枣、甘草益气健脾养血，共为佐药。重用大枣，既合当归、白芍以补营血，又防桂枝、细辛燥烈太过，伤及阴血。甘草兼调药性而为使药。全方选药精简，配伍得当，温阳与散寒并用，养血与通脉兼施，温而不燥，补而不滞。现代药理学研究证实，当归具有扩张冠脉血管、增加冠脉流量、降低心肌耗氧量、保护心肌细胞、抗血小板集聚、抗血栓形成、降血脂及抗动脉粥样硬化等作用。其有效成分阿魏酸钠能使血流增快，能明显抑制血小板聚集，也能使已聚集的血小板解聚，亦可使血小板减少[2]，可用来拮抗垂体后叶素引起的兔心肌缺血和结扎冠脉所致心肌梗死，并证明其能抗脂质过氧化损伤[3-4]。桂枝中的桂皮醛有明显抗血小板聚集和体内抗血栓作用[5]。白芍具有解痉、镇痛、镇静、耐缺氧等作用，其有效成分白芍总苷能有效对抗心肌缺血，保护心肌细胞，且白芍总苷还可清除自由基，减轻自由基损伤[6-7]。细辛具有明显的抗氧化作用，减轻氧自由基对细胞脂质的破坏作用，同时能够提高SOD的活性，增强机体对自由基的清除能力[8]。

图3当归四逆汤低剂量组心肌组织eNOS活性(×200)

图4当归四逆汤高剂量组心肌组织eNOS活性(×200)

图5复方丹参滴丸组心肌组织eNOS活性(×200)

血管内皮细胞不仅是血管壁的一种保护膜，而且还是一个内分泌器官，可以分泌多种因子，如内皮素(ET)、血管舒张因子(EDRF)等，这些活性因子发挥着重要的功能调节作用，因此内皮细胞在维持心血管稳态中起着重要作用。内皮细胞形态结构和功能改变，可能与动脉粥样硬化时血管内皮细胞一氧化氮合成分泌减少或/和内皮素分泌增加有关[9]。NO作为血管内皮舒张因子，具有舒张血管平滑肌、维持血管张力、抑制平滑肌细胞增生、抑制血小板聚集以及清除氧自由基等作用，其生物学效应与其产生来源、数量以及分泌时间、方式等有关[10]。NOS作为NO合成的关键酶，其活性变化直接调节NO的生成量及其生物学效应。NOS包括神经元型(nNOS)、内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS)等，其中eNOS与冠心病关系较为密切，NO正是其以左旋精氨酸为特异性底物催化生成的，具有保护心肌细胞功能的作用[11-12]。

本实验结果显示，模型组血清NO水平显著下降，同时eNOS活性显著降低，表明注射垂体后叶素后，血管内皮功能发生障碍。各给药组血清NO水平显著升高，eNOS活性增强，表明当归四逆汤与复方丹参滴丸一样均能有效保护和改善内皮功能，提高eNOS活性，促进NO的产生与释放，舒张冠脉血管。当归四逆汤不是单味药物作用的简单相加，具有临证加减化裁的优点，较中成药复方丹参滴丸更灵活、更个体化，从而更能发挥抗心肌缺血作用。

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Effect of Dangguisini decoction on the expression of NO and eNOS in serum of rats with myocardial ischemia

ZHANG Jifeng1, LIU Xiuli1, WANG Guoming1, WANG Yongli2

Objective It is to observe the effect of Dangguisini decoction on the expression of serum NO and eNOS in myocardial tissue in experimental myocardial ischemia rat model, and to provide experimental evidence for clinical application of coronary heart disease. Methods 50 male Wistar rats were randomly divided into blank group, model group, low dosage of Danggi sini decoction group [5 g drug/(kg·d)], high dosage of Danggi sini decoction group [10 g drug/(kg·d)] and compound Danshen pill group [0.081 g/(kg·d)], each group had 10 rats. Every treatment group was given respective drug 30 mL/kg by intragastric infusion, blank group and model group were given the same volume of normal saline, one time per day and treated for 5 days. In one hour after the last time of Intragastric infusion, all the groups except blank group were given pituitary oxytocin 30 IU/kg by intraperitoneal injection. In one hour after injection, the rats were killed and their serum NO level and eNOS activity in apical myocardial tissue were detected by immunohisto chemical method. Results The serum level of NO in model group was lower than that in blank group (P<0.05), while that in every treatment group were higher than that in model group (Pall<0.05), there was no significant difference between low dosage and high dosage groups of Dangguisini decoction (P>0.05). Light microscopy showed that the eNOS activity of the model group was weaker than that of the control group, while the activity of every treatment group were higher than that in model group. Conclusion Dangguisini decoction can enhance the activity of eNOS and promote the generation and release of endogenous NO, thus to play the protecting effect in the myocardial ischemia induced by pituitrin in rats.

Dangguisini decoction； myocardial ischemia；pituitrin；nitric oxide；endothelio nitric-oxide synthase

张戟风，男，讲师，研究方向为基础药理学。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.34.008

R-332

A

1008-8849(2015)34-3788-03

2015-04-02

(1. Cangzhou Medical College, Cangzhou 061001, Hebei, China; 2. Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, Hebei, China)