RKIP和VEGF在喉鳞癌及喉鳞状上皮不典型增生组织中的表达及临床意义

赫 莉，韩海平，冯志星，张慧平，要兆旭，连 蕾，杨 雪

(1. 河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001；2. 河北省人民医院，河北 石家庄 050051)

论 著

RKIP和VEGF在喉鳞癌及喉鳞状上皮不典型增生组织中的表达及临床意义

赫 莉1，韩海平1，冯志星1，张慧平2，要兆旭1，连 蕾1，杨 雪1

(1. 河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001；2. 河北省人民医院，河北 石家庄 050051)

目的通过检测Raf-1激酶抑制蛋白(RKIP)、血管内皮生长因子 (VEGF)在喉鳞癌及喉鳞状上皮不典型增生组织中的表达情况，分析二者在喉鳞癌发生、发展及转移中的作用及可能分子机制。方法采用免疫组化方法检测43例喉鳞癌组织、20例喉鳞状上皮不典型增生组织及9例正常喉黏膜组织中RKIP、VEGF的表达情况，分析其临床意义及二者之间的相关性。结果正常喉黏膜组织、喉鳞状上皮不典型增生组织及喉鳞癌组织中RKIP表达阳性率逐渐降低，VEGF表达阳性率逐渐上升，喉鳞癌组织中RKIP表达阳性率显著低于正常喉黏膜组织及喉鳞状上皮不典型增生组织(P均<0.05)；有转移的喉鳞癌组织中RKIP表达阳性率低于无转移的喉鳞癌组织(P<0.05)，VEGF表达阳性率高于无转移的喉鳞癌组织(P<0.05)。在正常喉黏膜组织、喉鳞状上皮不典型增生组织及喉鳞癌组织中，RKIP与VEGF的表达呈显著负相关(r=-0.324，P=0.006)。结论RKIP具有抑制喉鳞癌发展及转移的作用，这可能是通过下调VEGF表达来实现的。

Raf-1激酶抑制蛋白；血管内皮生长因子；免疫组化；喉鳞状细胞癌；喉鳞状上皮不典型增生

喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一，组织学上以鳞状细胞癌最多见。喉鳞癌的发生先从喉正常黏膜发展至鳞状上皮不典型增生，最终转变为喉鳞状细胞癌。Raf-1激酶抑制蛋白(Raf -1 kinase inhibitor protein，RKIP )被认为是一种肿瘤转移抑制基因，具有抑制肿瘤发生及转移的功能，其表达水平在恶性肿瘤的发展及预后评估方面具有重要的指导作用[1]。血管内皮生长因子(vascular epidermal growth factor ,VEGF)是血管生成刺激因子，在肿瘤外侵、转移中具有重要作用。本研究通过检测正常喉黏膜组织、喉鳞状上皮不典型增生组织、喉鳞癌组织中RKIP、VEGF的表达情况，以探讨二者在喉鳞癌发生、发展以及转移中的作用及可能机制，为喉鳞癌的诊断治疗提供新的方法。

1 临床资料

1.1一般资料 所有标本取自白求恩国际和平医院及邯郸市中心医院2007年1月—2014年2月收治患者，其中喉癌住院手术患者43例，男39例，女4例；年龄42～86岁，平均61岁；按国际抗癌协会(UICC)TNM分类标准(2002)修订的方案属于声门上型17例，声门型26例；T1期11例，T2期11例，T3期8例，T4期13例；临床Ⅰ期10例，Ⅱ期10例，Ⅲ期8例，Ⅳ期15例；有淋巴结转移10例，无淋巴结转移33例；术后病理均证实为鳞状细胞癌，均无远处器官转移。喉鳞状上皮不典型增生手术患者20例，男18例，女2例；年龄46～64岁，平均52岁；不典型增生重度4例，中度9例，轻度7例。9例正常喉黏膜组织取自行全喉切除的喉癌患者，声门型的喉癌在距原发灶边缘0.5 cm以外的范围采集，声门上型的喉癌在距原发灶边缘1.0cm 以外处采集，术后病理检测均为分化良好且无肿瘤组织浸润的鳞状上皮。所有病例资料完整，术前未接受放射治疗及化学治疗。

1.2材料 山羊抗人RKIP多克隆抗体，为美国Santa Cruz公司产品。鼠抗人VEGF多克隆抗体，即用型二步法免疫组织化学试剂盒，光谱超敏SP法试剂盒和浓缩型DAB试剂盒，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3实验方法 所有标本经10%福尔马林固定，4 μm连续切片，切片经DAB显色、苏木素复染、中性树胶封片等步骤处理。所有病理切片由3名病理医师在不知病例资料和肿瘤生物学特点的前提下阅片。对每张病理切片在高倍(×400)镜下至少观察10个不重复视野，判断细胞着色率和着色强度。

1.4结果判定标准 染色细胞内有棕色颗粒为阳性表达。①RKIP表达参考文献[2]采用半定量评分法判定：无阳性细胞为0分，阳性细胞<10%为1分，阳性细胞占10%～50%为2分，阳性细胞>50%～80%为3分，阳性细胞>80%为4分;染色强度按阴性、弱、中、强染色分别评为0～3分。最终评分按2个指标的乘积判定，0～3分为阴性(-)，4～8分为弱阳性(+)，9～12分为强阳性()。②VEGF表达参考文献[2]采用半定量评分法判定：阳性细胞<25%为0分，阳性细胞占25%～50%为1分，阳性细胞>50%～75%为2分，阳性细胞>75%为3分; 染色强度按阴性、弱、中、强染色分别评为0～3分。最终评分按2个指标的乘积判定，0～3分为阴性(-)，4～8分为弱阳性(+)，9～12分为强阳性()。

1.5统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行统计处理。计数资料比较采用2检验，RKIP与VEGF的相关性比较采用Spearman秩相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同组织中RKIP和VEGF镜下表达情况 RKIP、VEGF染色阳性表达均定位于细胞质，在正常喉黏膜的鳞状上皮基底层中，RKIP多为阴性表达，在基底层以上的细胞层次中，RKIP多为阳性表达,见图1。在喉鳞癌组织中分化较好的肿瘤细胞RKIP阳性表达较多，见图2。VEGF的表达情况则与之相反，见图3和图4。

图1 正常喉黏膜组织RKIP染色阳性表达情况(×400)

图2 喉鳞癌组织RKIP染色阳性表达情况(×400)

图3 正常喉黏膜组织VEGF染色阳性表达情况(×400)

图4 喉鳞癌组织VEGF染色阳性表达情况(×400)

2.2不同组织中RKIP和VEGF阳性表达情况 喉鳞癌组织中RKIP表达阳性率显著低于正常喉黏膜组织及喉鳞状上皮不典型增生组织(P均<0.05)，喉鳞状上皮不典型增生组织与正常喉黏膜组织相比差异无统计学意义(P>0.05)。正常喉黏膜组织、喉鳞状上皮不典型增生组织及喉鳞癌组织中VEGF表达阳性率有依次升高趋势，但各组织间比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 不同组织中RKIP和VEGF表达情况 例(%)

注：①与喉鳞癌组织比较，P<0.05。

2.3RKIP与VEGF在喉鳞癌组织中的表达与临床病理特征的关系 有淋巴结转移者RKIP表达阳性率显著低于无淋巴结转移者(P<0.05)，VEGF表达阳性率显著高于无淋巴结转移者(P<0.05)；不同年龄、肿瘤发病部位、T分期、临床分期、肿瘤分化程度间二者表达阳性率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 RKIP与VEGF在喉鳞癌组织中的表达与临床病理特征的关系 例

注：①与无转移比较，P<0.05。

2.4RKIP与VEGF的表达相关性分析 将RKIP与VEGF在正常喉黏膜组织、鳞状上皮不典型增生组织及喉鳞癌组织中的表达情况做Spearman秩相关分析，结果二者呈显著负相关性(r=-0.324，P=0.006)。见表3。

表3 RKIP与VEGF的表达相关性分析 例

3 讨 论

晚期喉鳞癌无论手术或放疗，疗效均不佳，其发生发展机制尚未完全阐明。RKIP是磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein, PEBP)家族成员之一，是广泛存在于人体组织中的一种高度保守的蛋白[3],它通过参与丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK) 信号通路、核因子κB (nuclear factor-κB, NF-κB)信号通路、G蛋白偶联信号通路等多条信号通路发挥自身作用，影响细胞的生长、增殖及分化[4-6]。RKIP是一种肿瘤转移抑制基因，其在肿瘤细胞中表达上调能够促进肿瘤细胞分化，抑制肿瘤细胞的增殖及侵袭能力；其表达下调能够使肿瘤细胞稳定性下降，进而导致肿瘤细胞的侵袭力、转移力增加，促进周围侵袭及转移发生。陈彦等[7]在RKIP低表达与鼻咽癌侵袭转移和NF-κB信号通路活化相关的研究中发现，RKIP可能是鼻咽癌的一个转移抑制蛋白，RKIP表达下调可能通过活化NF-κB信号通路促进鼻咽癌细胞侵袭和转移。胡那日苏等[8-9]研究发现RKIP表达的减少或缺失与腺样囊性癌、口腔涎腺黏液表皮样癌的发生发展、侵袭转移密切相关。本研究结果发现，喉鳞癌组织中RKIP表达阳性率显著低于正常喉黏膜组织及喉鳞状上皮不典型增生组织，有淋巴结转移者RKIP表达阳性率低于无淋巴结转移者。提示RKIP与喉鳞癌的发生发展密切相关，RKIP表达阳性率低的喉鳞癌更易发生转移，RKIP可抑制喉鳞癌发生转移。本研究中喉鳞状上皮不典型增生组织与正常喉黏膜组织相比差异无统计学意义，这可能是由于样本量小或者免疫组化方法的敏感度尚不足以反映其差异，这一问题有待于进一步研究。

VEGF是血管生成刺激因子，它能够与血管内皮细胞特异性相结合，促进血管内皮细胞增殖，增强血管通透性，是作用最强的血管生成因子之一[10]。许多实体肿瘤的生长过程中需要血管为其提供营养物质，所以VEGF在肿瘤的生长、侵袭及转移中起着重要作用。本研究发现，有转移的喉鳞癌组织中VEGF表达阳性率高于无转移的喉鳞癌组织，故认为VEGF的表达上调可能是促进淋巴结转移的分子机制之一。

综上所述，在正常喉黏膜到喉鳞状上皮不典型增生再到喉鳞癌的逐渐转变过程中，RKIP表达是逐渐下降的，VEGF表达是逐渐上升的，RKIP与VEGF表达呈负相关性。由此推测，RKIP具有抑制喉鳞癌发展及转移的作用，其可能的分子机制为RKIP通过某些途径下调了VEGF的表达，从而实现抑制喉鳞癌发展及转移的作用。

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Expressions and clinical significance of RKIP, VEGF in laryngeal squamous cell carcinoma, laryngeal squamous epithelium atypical hyperplasia

HE Li1, HAN Haiping1, FENG ZHI Xing1, ZHANG Huiping2, YAO Zhaoxu1, LIAN Lei1, YANG Xue1

(1.Handan Central Hospital, handan 056001, Hebei, China; 2.Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, Hebei, China)

Objective It is to observe the expressions and clinical significance of Raf-1 kinase inhibitor protein (RKIP), vascular endothelial growth factor (VEGF) in laryngeal squamous cell carcinoma and laryngeal squamous epithelium atypical hyperplasia, and analyze the action of RKIP, VEGF in the occurrence and development of laryngeal squamous cell carcinoma as well as the possible molecular mechanisms. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expressions of RKIP and VEGF in 43 cases of laryngeal squamous cell carcinoma tissue, 20 cases of laryngeal squamous epithelium atypical hyperplasia tissue and 9 cases of normal larynx squamous epithelium tissue. The clinical significance and correlation of them were analyzed. Results The expression of RKIP in normal larynx squamous epithelium tissues, laryngeal squamous cell carcinoma tissues and laryngeal squamous cell carcinoma tissues was decreased gradually, and the positive rate of VEGF expression was increased gradually. RKIP expression in laryngeal squamous cell carcinoma tissues was lower than that in normal larynx squamous epithelium tissues and laryngeal squamous epithelium atypical hyperplasia tissue (allP<0.05). RKIP expression in squamous cell carcinoma tissues with metastasis was significantly lower than that in squamous cell carcinoma tissues without metastasis (P<0.05), and VEGF expression was significantly higher than that in squamous cell carcinoma tissues without metastasis (P<0.05). In all cases, RKIP expression had negative correlation with VEGF expression (r=-0.324,P=0.006).Conclusion The RKIP may have the action of inhibition migration and metastasis in laryngeal squamous cell carcinoma by down-regulating VEGF expression.

Raf-1 kinase inhibitor protein; vascular endothelial growth factor; immunohistochemistry; laryngeal squamous cell carcinoma; laryngeal squamous epithelium atypical hyperplasia

赫莉，女，主治医师，主要从事耳鼻咽喉头颈外科工作。

河北省卫生厅科研基金项目(20150462)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.27.001

R-33

A

1008-8849(2015)27-2965-04

2015-03-30