电针后外敷威灵仙浸膏治疗日本大耳白兔实验性膝骨关节炎的研究

李 敏，丁武华，李 莉，方 伟，郭俐宏

(1.湖北省十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)，湖北 十堰 442000；2.湖北医药学院，湖北 十堰 442000)

电针后外敷威灵仙浸膏治疗日本大耳白兔实验性膝骨关节炎的研究

李 敏1，丁武华1，李 莉2，方 伟2，郭俐宏2

(1.湖北省十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)，湖北 十堰 442000；2.湖北医药学院，湖北 十堰 442000)

目的 研究电针配穴联合自制威灵仙浸膏外敷治疗实验性日本大耳白兔膝骨关节炎合并关节腔积液的效果及作用机制。方法 将日本大耳白兔36只随机分为模型组、电针组、威灵仙组及联合组，4组均于第1，3，7天各注射1次弗氏完全佐剂(0.1 mL)于左膝关节腔内造模；造模成功后电针组取足三里、血海、阳陵泉为主穴电针刺激30 min,威灵仙组于膝骨关节处每日涂抹威灵仙浸膏,联合组在电针足三里、血海、阳陵泉30 min后膝骨关节处每日涂抹威灵仙浸膏,均治疗2周。分别于造模前及治疗后2周测定关节积液中炎症递质前列腺素E2(PGE2)、透明质酸(HA)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平；计算足趾关节肿胀率及消肿时间，并于治疗结束后取动物关节软骨测定软骨MMP-1细胞阳性表达率。结果 治疗2周后，联合组PGE2、IL-1β水平,MMP-1细胞阳性表达率及足趾关节肿胀率均明显低于治疗前及电针组、威灵仙组(P均<0.05),消肿时间明显短于电针组、威灵仙组(P均<0.05)，HA水平高于电针组、威灵仙组(P均<0.05)。结论 电针配穴联合自制威灵仙浸膏外敷治疗日本大耳白兔实验性膝骨关节炎合并关节腔积液效果好。其作用机制可能是电针刺激可激发经气，降低痛阈，威灵仙浸膏经皮吸收后可促进局部血液循环及局部病变组织新陈代谢，增加HA分泌，抑制IL-1β的合成，二者协同促使病变组织恢复，减轻关节疼痛。

威灵仙浸膏；膝骨关节炎;前列腺素E2；透明质酸；软骨MMP-1细胞

中医学认为，膝骨关节炎是由于膝关节局部湿浊痹阻及血瘀气滞而起，归“骨痹”“筋痹”范畴，治当利湿除痹、舒筋通络、活血化瘀、行气止痛[1]。当膝关节滑膜受到劳损、外伤、感染等刺激后，滑膜下层毛细血管扩张，毛细血管通透性增大，致使关节内产生大量渗出液，出现关节积液[2]。威灵仙为毛莨科植物威灵仙干燥根及根茎，《本草纲目》记载威灵仙“味微辛咸”，通经络、消痰涎、祛风湿、散癖积[3],药性辛散温通，通行十二经脉，既能祛风湿，又能通经止痹痛。其主要有效成分为常春藤皂苷元及齐墩果酸，具有清热、消炎抑菌、强心、利尿作用[4]。本实验采取电针配穴联合自制威灵仙浸膏外敷治疗实验性日本大耳白兔膝骨关节炎合并关节腔积液，以期研究联合治疗的镇痛消炎作用机制，为临床提供安全可靠的治疗膝骨关节炎合并关节腔积液治疗方案。

1 实验资料

1.1实验动物及分组 日本大耳白兔36只，体质量(2 500±50)g，雌雄兼用，实验动物由湖北医药学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证：SCXK(鄂)2011-0008；实验动物设施使用许可证：SYXK(鄂)2011-0031。采用随机数字表编号，随机分为模型组、电针组、威灵仙组及联合组，每组9只。

1.2 仪器设备及药品试剂 SDZ-Ⅱ型电子针疗仪(上海坤弘)；弗氏完全佐剂(上海实生细胞生物技术有限公司)；生理盐水；威灵仙浸膏组方及自制方法：威灵仙10 g、透骨草30 g、当归20 g、川乌10 g、海桐皮30 g、红花15 g、伸筋草30 g、川牛膝15 g、艾叶10 g、木瓜15 g、草乌10 g、桂枝10 g、防风10 g碾成粉末(药材由太和医院中药房提供)，混合凡士林并加少许香油调成糊状备用。

1.3 动物模型制备 造模时先剃掉兔膝关节及以下毛发，碘伏消毒，采用日本鬼头康彦膝骨关节炎造模法[5]，将弗氏完全佐剂0.1 mL于第1，3，7天注入左膝关节腔内，根据临床上超疲劳容易提前出现骨关节炎的发病特点，每日强迫动物活动30 min，14 d后出现以下与临床急性膝关节炎表现一致的症状即可确定大鼠急性膝关节炎模型造模成功：①关节及其周围僵硬、活动受限；②关节出现红、肿、热、痛，同时软组织肿胀或积液；③发病的部位常见于膝、髋、踝等关节处；④关节积液检查出现白细胞介素-1β(IL-1β)降低、透明质酸(HA)含量明显升高；⑤关节病理切片镜检出现关节腔大量渗出液，软骨表面粗糙，滑膜增生、粘连、肥厚等膝关节炎临床病理学改变。

1.4 治疗方法 将兔固定于兔固定器，电针组取足三里、血海、阳陵泉为主穴，用一次性无菌针灸针齐刺，旁开1寸两旁各刺1针，其针尖与正中一针的针尖汇合，刺入骨膜，行导气手法，使针感向膝周扩散为佳；以齐刺点为正极，配穴为负极，接 SDZ-Ⅱ型电子针疗仪，连续波，频率10 Hz，留针30 min。威灵仙组仅将威灵仙浸膏均匀涂抹在无菌纱布上，覆盖于兔膝部并用弹性绷带包扎。联合组先给予电针组相同治疗，在电针齐刺完成后，将威灵仙浸膏均匀涂抹在无菌纱布上，覆盖于兔膝部并用弹性绷带包扎。模型组每日仅消毒。以上治疗1次/d，14 d为1个疗程。

1.5 检测指标及方法 ①于治疗前后分别抽取兔膝关节腔积液，测定积液中前列腺素E2(PGE2)、IL-1β、HA含量。②病理检查患者软骨MMP-1阳性表达率(阳性细胞数/细胞总数×100%)。③计算膝关节肿胀百分率。方法：先取100 mL量筒注入蒸馏水，液面与量筒最高处平齐，用50 mL注射器吸取量筒内蒸馏水约30 mL。于每只兔左膝关节缝矢状面用记号笔做一标记，然后把兔左足缓慢伸入量筒内，使标记与量筒最高处平齐。再用已吸入30 mL水的注射器向量筒内缓慢注入蒸馏水并使液面再次与最高处及兔膝关节标记处一致，读取注射器内剩余液体体积，再用30 mL-注射器内剩余液体体积即为兔的左膝关节容积，重复3次取平均值。左膝关节肿胀百分率(%)=(造模后容积-造模前容积)/造模前容积×100%。

2 结 果

2.1治疗前后各组PGE2、IL-1β、HA水平及MMP-1阳性表达率比较 治疗后电针组、威灵仙组、联合组PGE2水平及MMP-1阳性表达率均低于本组治疗前及模型组(P均<0.05)，威灵仙组与电针组比较差异无统计学意义；联合组PGE2、IL-1β水平及MMP-1阳性表达率均明显低于电针组及威灵仙组(P均<0.05)，HA明显高于电针组及威灵仙组(P均<0.05)；电针组HA有一定的升高，IL-1β有降低趋势，但与本组治疗前及模型组比较差异无统计学意义；威灵仙组HA高于本组治疗前及电针组(P均<0.05)， IL-1β明显低于本组治疗前及电针组(P均<0.05)。见表1。

2.2 治疗前后各组足肿胀度及消肿时间比较 治疗后电针组、威灵仙组、联合组足肿胀度明显低于本组治疗前及模型组(P均<0.05)。威灵仙组与电针组足肿胀度及消肿时间比较差异无统计学意义。联合组足肿胀度及消肿时间明显低于电针组及威灵仙组(P均<0.05)。见表2。

3 讨 论

膝关节炎常出现关节积液，其病理改变为关节腔及滑膜炎性浸润，造成关节面软骨被破坏、变性并继发滑液炎症，是关节软骨细胞的分解与合成代谢紊乱造成的慢性、退行性关节疾病[6]。临床上多发于35岁以上的中年人，临床以膝关节疼痛、变形和活动受限为主要特点，目前治疗多以抗炎、消肿为主，但疗效并不理想。中医认为，当膝关节因外伤或其他原因受损伤后，局部关节血瘀气滞，湿浊之气痹阻于膝，针灸可以舒筋通络、行气止痛，中药内服外敷可以活血化瘀、利湿除痹，联合应用效果较好[7]。本研究所选的阳陵泉穴可强筋祛湿，主治膝痹；足三里具有养血益气之功效，主治下肢痿痹；血海穴主活血，与阳陵泉及足三里配伍具有舒筋活络、利通关节之奇效。且电针刺激可激发经气，降低痛阈，减轻关节滑膜表面神经末梢对炎性因子IL-1β、PGE2刺激的反应敏感度[8]。而中药威灵仙有活血化瘀、祛风除湿、消肿抗炎镇痛作用，能改善关节腔内环境而达“通则不痛”的功效；且威灵仙浸膏吸收后可促进局部组织血液循环及新陈代谢，促使滑膜内衬B型滑膜细胞和单核吞噬细胞大量分泌HA，达到润滑关节、延缓软骨退变及保护关节软骨的作用；还可抑制机体产生过多的IL-1β及PGE2等炎症因子，减轻对关节软骨细胞的破坏，减少关节内渗出液[9-10]。

表1 治疗前后各组PGE2、IL-1β、HA水平及MMP-1阳性表达率比较

注：①与治疗前比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与联合组比较，P<0.05；④与电针组比较，P<0.05。

表2 治疗前后各组足肿胀度及消肿时间比较

注：①与治疗前比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与联合组比较，P<0.05。

正常的关节滑液中仅含有微量的IL-1β，但在膝关节骨性关节炎合并关节腔积液时，IL-1β的含量则会异常增高。PGE2是机体的主要炎症因子和重要的细胞生长和调节因子，是花生四烯酸环氧合酶代谢产物，为二十碳不饱和脂肪酸，当出现感染时，PGE2大量产生。HA是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖胺二糖单位有规律重复构成的大分子链状多糖，是关节滑液和软骨基质的重要组成部分。HA可减少膝关节炎关节内PGE2等炎性递质的合成及扩散，减轻滑膜的通透性及关节内渗液[11]。正常关节软骨中MMP-1细胞阳性表达极低，在膝骨关节炎早期常出现关节滑液IL-1β、PGE2及MMP-1细胞阳性表达率升高及HA降低的现象。故本实验研究采用电针联合威灵仙浸膏外敷治疗膝骨性关节炎合并关节腔积液动物模型，以IL-1β、HA、PGE2及MMP-1细胞阳性表达率为主要生化指标来衡量该治疗方案的疗效。

本研究结果显示，联合组PGE2、IL-1β水平及MMP-1阳性表达率均明显低于电针组及威灵仙组，HA明显高于电针组及威灵仙组。提示电针刺激并配合威灵仙浸膏外敷联合治疗可减少炎症因子PGE2、IL-1β的产生，抑制MMP-1的阳性表达，促进HA的分泌，疗效明显优于单用电针刺激或威灵仙浸膏外敷法，对临床治疗膝关节炎合并关节积液有一定的参考价值。

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Experimental study on external application of Clematis chinensis extract after acupuncture treatment in Japanese big ear rabbits with experimental knee osteoarthritis

LI Min1,DING Wuhua1,LI Li2,FANG Wei2,GUO Lihong2

(1.Shiyan Taihe Hospital (Affiliated to Hubei Medical College),Shiyan 442000,Hubei,China; 2.Hubei Medical College,Shiyan 442000,Hubei,China)

Objective It is observe the effect of electro acupuncture combined with self-made Clematis extract by external application on the Japanese big ear rabbits of experimental knee osteoarthritis (KOA)with joint effusion,and to explore its anti inflammation mechanism.Methods 36 white rabbits were randomly divided into model group,electro-acupuncture group,Clematis group and combined treatment group.All the rabbits were given complete Freund's adjuvant (0.1 mL) in the left knee joint cavity one time on the first,third and 7th day to establish models of KOA.After the models successfully established,electro-acupuncture group was treated with electro-acupuncture at Zusanli,Xuehai,Yanglingquan for 30 min; Clematis group was treated with Clematis extract on knee joint daily by external application; combined treatment group was treated with both electro-acupuncture and Clematis extract.All the treatment lasted for 2 weeks.The levels of PGE2,HA,IL-1β in joint effusion were determined before model establish and 2 weeks after treatment in all groups; toes swelling rate and swelling time of joint were counted,and the animal articular cartilage was gotten to detect the positive expression rate of MMP-1 cartilage cells at the end of treatment.Results After 2 weeks' treatment,the levels of PGE2,IL-1β,the positive rate of expression of MMP-1 cell rate and the toe joint swelling rate were significantly lower than that before treatment and the other two groups,swelling time was shorter while the level of HA was higher in combination group compared with that in the other two groups.Conclusion Electro-acupuncture combined with self-made Clematis extract topical therapy can be effective in the treatment of Japanese big ear rabbits of experimental knee osteoarthritis with joint effusion.The mechanism may be that: electro-acupuncture can arouse the Qi and decrease pain threshold,the extract can promote the local blood circulation and local tissue metabolism,increase the secretion of HA,inhibit IL-1β production,thus to promote the recovery of pathological tissue and relive joint pain together.

Clematis extract; knee osteoarthritis; prostaglandin E2; hyaluronic acid; MMP-1 cell

李敏，女，研究方向为中医药药理及护理。

李莉，E-mail：951777718@qq.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.13.009

R-332

A

1008-8849(2015)13-1394-03

2014-12-01